雷公藤組織培養(yǎng)技術(shù)研究.pdf

1、雷公藤(Tripterygium wilfordii)作為一種重要的殺蟲植物和傳統(tǒng)的中藥材,近年來(lái)在無(wú)公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥臨床方面的需求不斷增加,造成野生資源急劇減少。為保護(hù)雷公藤自然資源,實(shí)現(xiàn)其資源的可持續(xù)利用,有必要對(duì)雷公藤組織培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)行系統(tǒng)研究,還要解決組培過程中材料易褐變的難題,以提高組培成功率。本試驗(yàn)以雷公藤的嫩葉、幼莖及根為外植體,對(duì)外植體滅菌、啟動(dòng)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生、外植體褐化等方面進(jìn)

2、行了研究,探討外植體的消毒程序、基本培養(yǎng)基的篩選、最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度及組合等對(duì)雷公藤組織培養(yǎng)的影響,外植體褐變的過程和機(jī)理及其抑制處理,為雷公藤的組培工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)外植體消毒處理:就雷公藤外植體的取材部位和取材時(shí)間來(lái)說(shuō),以4月-6月取雷公藤嫩葉、帶頂芽或腋芽的幼莖經(jīng)過75％酒精處理20-30s后,再以0.1％HgCl2溶液滅菌4min的處理效果最好,平均污染率只有153％,平均存活率為

3、83.7％；其次是以75％酒精處理45s后,再以0.1％HgCl2溶液滅菌4min,平均污染率為14.8％,平均存活率可以達(dá)到74.7％；以7月-9月消毒最難,尤其是根最不容易消毒,平均污染率高達(dá)58.1％,而平均存活率僅有21.5％。
　　 (2)啟動(dòng)培養(yǎng):外植體以4月-6月帶項(xiàng)芽或腋芽的幼莖段為好。NAA對(duì)芽體啟動(dòng)速度有顯著性影響。較低濃度的NAA促進(jìn)啟動(dòng)速度加快,提早萌芽:當(dāng)NAA濃度超過0.1mg／L時(shí)則易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象

4、。當(dāng)6-BA濃度超過1.0mg／L時(shí)會(huì)導(dǎo)致愈傷組織的出現(xiàn)或芽生長(zhǎng)細(xì)弱,不利于芽苗萌動(dòng)。芽啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA0.05mg／L+6-BA0.5mg／L,外植體萌芽快,平均啟動(dòng)速度達(dá)到3.2d,萌芽率高,苗綠,節(jié)間距較大,適合繼代培養(yǎng)。
　　 (3)增殖培養(yǎng):不同基本培養(yǎng)基與6-BA濃度水平對(duì)雷公藤月增殖系數(shù)均有極顯著性影響,不同NAA和蔗糖濃度水平對(duì)增殖則無(wú)顯著性影響?；九囵B(yǎng)基類型、6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃

5、度四者對(duì)增殖效果影響的主次關(guān)系是:基本培養(yǎng)基類型>6-BA濃度>NAA濃度>蔗糖濃度。增殖培養(yǎng)的最佳組合為1／2MS+6-BA2.0 mg／L+NAA1.0mg／L+蔗糖25 g／L,月增殖系數(shù)最高達(dá)5.83。
　　 (4)壯苗培養(yǎng):試驗(yàn)中1／2MS+NAA0.1mg／L+GA30.05mg／L組合最有利于壯苗培養(yǎng)。
　　 (5)生根培養(yǎng):基本培養(yǎng)基、IBA和活性炭三者對(duì)生根率影響的主次關(guān)系為:基本培養(yǎng)基>IBA>活性炭

6、?；九囵B(yǎng)基對(duì)生根率有極顯著性影響,IBA的濃度水平對(duì)生根率有顯著性影響,而活性炭濃度水平對(duì)生根率無(wú)顯著性影響。1／2MS培養(yǎng)基對(duì)雷公藤組培苗生根率的效應(yīng)最好,平均生根率達(dá)到67.3％。組培苗生根的最佳組合為:1／2MS+IBA2.0mg／L+C0.5g／L。ABT1、ABT3各濃度均可誘導(dǎo)生根,以處理R11:1／2MS+ABT10.6mg／L和R16:1／2MS+ABT30.8mg／L生根率較高,分別達(dá)到74.63％和73.66％。<

7、br>　　 (6)煉苗移栽:不同煉苗方式對(duì)組培苗移栽成活率有極顯著影響。最佳處理方式是:閉瓶鍛煉6d后開瓶煉苗6d的移栽成活率最高,平均移栽成活率達(dá)92.44％:其次是閉瓶鍛煉6d后開瓶煉苗3d,平均移栽成活率也達(dá)到了84.95％。不同基質(zhì)對(duì)移栽成活率有極顯著影響。最有利于移栽的基質(zhì)為沙子:紅壤土:泥炭土=1:1:1,平均移栽成活率高達(dá)87.31％；其次是沙子,平均移栽成活率為50.08％。
　　 (7)愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和再

8、生植株:采用雷公藤的嫩葉、幼莖為愈傷組織的誘導(dǎo)材料,建立雷公藤愈傷組織體系。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)中,嫩葉、幼莖的誘導(dǎo)率都在90％以上,但幼莖的誘導(dǎo)情況更好,褐變率比嫩葉低27％左右。且出愈時(shí)間也較嫩葉提前5d?；九囵B(yǎng)基、2,4-D、6-BA和蔗糖四者對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率影響的主次關(guān)系為:基本培養(yǎng)基>2’4.D>6-BA>蔗糖。基本培養(yǎng)基、2,4-D濃度與6-BA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率均有極顯著性影響,而蔗糖濃度對(duì)誘導(dǎo)率無(wú)顯著性影響。誘導(dǎo)愈

9、傷組織的最佳培養(yǎng)基為:MS+2,4-D1.0 mg／L+6-BA1.0 mg／L+蔗糖30 g／L,誘導(dǎo)率最高,達(dá)到93.62％。在愈傷組織繼代培養(yǎng)試驗(yàn)中,2,4-D、6-BA和IBA三者對(duì)愈傷組織增長(zhǎng)量影響的主次關(guān)系為:2,4-D>6-BA>IBA。2,4-D濃度對(duì)愈傷組織繼代增長(zhǎng)量有極顯著性影響,6-BA濃度對(duì)愈傷組織增長(zhǎng)量有顯著性影響,而IBA濃度則無(wú)顯著性影響。愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為:MS+2,4-D1.0 mg／L+6

10、.BA1.0 mg／L+IBA0.5mg／L。在愈傷組織分化培養(yǎng)試驗(yàn)中,IBA、6-BA和KT三者對(duì)愈傷組織分化率影響的主次關(guān)系為:6-BA>IBA>KT。6-BA濃度對(duì)愈傷組織分化出芽率有極顯著性影響,IBA濃度有顯著性影響,而KT濃度則無(wú)顯著性影響。愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為:MS+IBA0.5mg／L+6-BA1.0mg／L+KT0.5mg／L。
　　 (8)外植體褐變機(jī)理及防褐變處理:雷公藤嫩葉、幼莖進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

11、時(shí),嫩葉較幼莖易發(fā)生褐變現(xiàn)象。研究這兩種外植體總酚含量、多酚氧化酶(PPO)活力和組培褐變率的變化規(guī)律及其關(guān)系得知,兩種外植體的總酚含量在4～10月間變化都呈一單峰曲線,含量高峰出現(xiàn)在7月份,嫩葉為28.36mg／g,幼莖為8.42 mg／g。PPO活力兩種外植體在不同時(shí)期的變化趨勢(shì)也是一致,活力高峰出現(xiàn)在6月份,嫩葉為10U／g.min,幼莖為9.6U／g.min。同期組培褐變率表現(xiàn)為:兩種外植體的褐變高峰均出現(xiàn)在7月份,嫩葉為55％

12、,幼莖為10％。分析三者的相關(guān)性表明:總酚含量、PPO活力與組培褐變率都存在一定的關(guān)系,總酚含量是決定組培褐變率高低的主導(dǎo)因素。嫩葉抗褐化研究結(jié)果表明:培養(yǎng)初期選用液體培養(yǎng)基可以減輕外植體的褐變和死亡情況；暗培養(yǎng)和冷藏預(yù)處理能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)褐化起到一定的抑制作用；接種前在1.0g／LPVP溶液中切割外植體可以減輕褐變:3 d轉(zhuǎn)瓶1次降低褐化的效果很好；培養(yǎng)基中加入20 mg／L AgNO3不但對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響不大,而且有效的減輕外植體