艾滋病患者合并肺孢子菌肺炎的分子診斷及肺孢子菌基因多態(tài)性研究.pdf

1、肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia,PCP)是免疫功能低下人群尤其是艾滋病患者中最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染和最主要死亡原因之一，導(dǎo)致 PCP的病原體是耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ)，該病原體從1909以來(lái)一直被認(rèn)為是原蟲,但在1988年證實(shí)是一種介于子囊(真)菌亞門與擔(dān)子(真)菌亞門之間的真核生物，為真菌家族的一員。臨床診斷 PCP病例依靠臨床表現(xiàn)，確診需要發(fā)現(xiàn) P

2、J的滋養(yǎng)體和/或包囊。然而，由于 PJ不能體外培養(yǎng)，一般采取染色方法進(jìn)行診斷，但該方法陽(yáng)性率低，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，制約了 PCP的病原學(xué)診斷，容易造成誤診和漏診。近年來(lái)，國(guó)外多項(xiàng)研究認(rèn)為，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)序方法可以明顯提高 PCP診斷的敏感性與特異性，可成為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，診斷目的基因以線粒體大亞基 rRNA
　　(mtLSUrRNA)的敏感性和特異性最好。然而，國(guó)內(nèi)有關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，迄今仍缺乏統(tǒng)一的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。有研究證實(shí)

3、，自然環(huán)境中和宿主感染的 PJ具有基因多態(tài)性，長(zhǎng)期使用磺胺類藥物可能導(dǎo)致耐藥 PJ。最常用的分型序列是 mtLSUrRNA基因、rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、細(xì)胞色素 B（CYB)基因、二氫蝶酸合成酶(DHPS)基因及二氫蝶酸還原酶(DHFR)基因，而后三條基因還是藥物作用靶點(diǎn)，可用于耐藥位點(diǎn)監(jiān)測(cè)。迄今為止，我國(guó)艾滋病患者 PJ感染的基因多態(tài)性仍是個(gè)謎，其潛在耐藥位點(diǎn)也未明了。因此，本研究擬在我國(guó)南方地區(qū)艾滋病合并肺部感染患者中應(yīng)

4、用PCR方法，探討其診斷 PCP的價(jià)值；同時(shí)，了解我國(guó)南方地區(qū)艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多態(tài)性、基因分型及潛在耐藥位點(diǎn)。
　　研究目的：
　　1.探討 PCR方法在診斷艾滋病合并 PCP中的價(jià)值，以提高 PCP的病原學(xué)診斷率。
　　2.分析我南方地區(qū)艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多態(tài)性、基因分型及潛在耐藥位點(diǎn)，以了解該地區(qū)艾滋病患者 PCP的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1.收

5、集2012年1月至2014年9月在我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者臨床資料，包括：性別、年齡、CD4細(xì)胞數(shù)值、有無(wú)使用過(guò) HARRT治療、有無(wú)使用磺胺類藥物、是否為初次感染、預(yù)后情況等。以158例患者為入組對(duì)象，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　2.收集入組患者 BALF，提取 PJ-DNA后，將 PJ-mtLSU rRNA作為目的基因采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出 PJ-DNA并通過(guò)測(cè)序得到 mtLSU rRNA基因位

6、點(diǎn)序列可診斷 PCP，統(tǒng)計(jì)采用PCR法診斷 PCP的例數(shù)得到檢測(cè)率。結(jié)合本研究入組對(duì)象的臨床資料以及 GMS染色的結(jié)果，并將確診 PCP的患者作為研究對(duì)象，比較確診 PCP患者均采用PCR法與 GMS染色法這兩種診斷方法得到的結(jié)果，分析結(jié)果并總結(jié) PCR作為 PCP的分子診斷方法的意義。
　　3.基因多態(tài)性分析：針對(duì)PCR方法得到的PJ-mtLSU rRNA陽(yáng)性標(biāo)本，再進(jìn)行4個(gè)基因的擴(kuò)增。然后對(duì)5個(gè)基因產(chǎn)物（包括mtLSU rRN

7、A基因、DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因）進(jìn)行測(cè)序分析，確定各個(gè)基因分型。通過(guò)GenBank中原型序列比較有無(wú)新型序列的發(fā)現(xiàn)，本研究結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組定性資料的比較采用卡方檢驗(yàn)（χ2 Test），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究對(duì)象及研究方法：
　?。?）研究對(duì)象：
　　以2012年1月至2014年9月我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者的

8、肺泡灌洗液（BALF）作為研究對(duì)象，各種診斷參考本文研究方法的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　?。?）研究方法
　　1）收集研究對(duì)象的臨床資料，建立臨床資料的數(shù)據(jù)庫(kù)。
　　2）針對(duì)研究對(duì)象提取 PJ-DNA后運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因 mtLSU rRNA，其中PCR能夠擴(kuò)增出 mtLSU rRNA基因的確定為 PCR診斷 PCP陽(yáng)性。參考回顧性分析的臨床資料得到臨床診斷為 PCP的例數(shù)，同時(shí)對(duì)研究對(duì)象中采用GMS染色法診斷為 PCP的

9、例數(shù)以及采用PCR測(cè)序法診斷為 PCP的例數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。并以臨床診斷+PCR測(cè)序/GMS染色法確診 PCP的患者作為研究對(duì)象，采用PCR法與 GMS染色法兩種方法檢測(cè)確診 PCP患者的檢測(cè)率進(jìn)行比較。
　　3）對(duì)于成功擴(kuò)增出 PJ-mtLSU rRNA的陽(yáng)性標(biāo)本，繼續(xù)擴(kuò)增 DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因這四個(gè)基因。然后結(jié)果去測(cè)序、對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析、將得到的分型與 Genbank里面的原型進(jìn)行比對(duì)。
　　4

10、）本研究結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組定性資料的比較用卡方檢驗(yàn)（χ2 Test），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。=
　　研究結(jié)果：
　　（1）在2012年1月至2014年9月期間收治在廣州市第八人民醫(yī)院的158例 AIDS合并肺部感染的患者中采用PCR方法成功檢測(cè)出PJ例數(shù)有56例，占總例數(shù)的35.4％。結(jié)果表示 PCR方法診斷 PCP檢測(cè)率為35.4%.
　?。?）158例 AIDS合

11、并肺炎患者中臨床診斷 PCP的例數(shù)為51，占總例數(shù)的32.2%；GMS染色鏡檢診斷 PCP的例數(shù)31例，占總例數(shù)的19.6%；PCR診斷 PCP的例數(shù)56，占總例數(shù)的35.4%。將確診為 PCP的51例標(biāo)本作為研究對(duì)象，比較其運(yùn)用PCR方法與 GMS染色鏡檢這兩種方法得到的診斷 PCP的例數(shù)，同時(shí)比較這兩種方法的敏感性，探討 PCR方法運(yùn)用于 PCP診斷的意義。經(jīng)卡方檢驗(yàn)得出結(jié)論是 PCR法的敏感性高于 GMS染色法（P=0.000）。

12、
　?。?）以mtLSU rRNA為目的基因擴(kuò)增出的 PJ陽(yáng)性例數(shù)有56例，比對(duì) Genbank里面的原型序列，均符合原型在85、248的2個(gè)位點(diǎn)分型，一共分為5型，各型的比例分別是基因型1型占23%、基因型2型占23%、基因型3型占16%、基因型4型占34%、基因型5型占4%。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的基因型。
　　（4）針對(duì)研究對(duì)象以DHFR、DHPS、ITS、CYB四個(gè)基因?yàn)槟康幕蚶^續(xù)采用PCR技術(shù)檢測(cè) PJ，以DHFR為目的基因

13、成功擴(kuò)增出38個(gè) PJ陽(yáng)性樣本，通過(guò)與基因庫(kù)的 PJ參考序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn) DHFR具有多態(tài)性，當(dāng)中12例樣本在312位點(diǎn)是有混合 PJ株感染，1例在188位點(diǎn)有混合 PJ株感染，未發(fā)現(xiàn)新型基因型及耐藥相關(guān)的位點(diǎn)突變。以DHPS為目的基因成功擴(kuò)增出40個(gè) PJ陽(yáng)性樣本，通過(guò)與基因庫(kù)的 PJ參考序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn) DHPS具有多態(tài)性，當(dāng)中有3例在耐藥相關(guān)位點(diǎn)163、169有發(fā)生堿基突變，其他均與原型一致，未發(fā)現(xiàn)新型基因。以ITS為目的基因成功

14、擴(kuò)增出53個(gè) PJ陽(yáng)性樣本，獲得53條 ITS1和53條 ITS序列，通過(guò)與基因庫(kù)的 PJ參考序列進(jìn)行比對(duì)獲得 ITS1基因型8型（A、B、D、E、G、I、SYD、DELIr）和4條新序列；ITS2基因型7型（b、e、g、h、p、i、r）和4條新序列，一共獲得14種組合序列，當(dāng)中“BTM4g、BTM1i”是新發(fā)現(xiàn)的組合型，之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)；Eg是最常見(jiàn)的 ITS基因型；ITS基因比較復(fù)雜具有明顯多態(tài)性。以CYB為目的基因成功擴(kuò)增出51個(gè)

15、PJ陽(yáng)性樣本，通過(guò)與基因庫(kù)的 PJ參考序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與已知基因型相符的有44例，分別有 CYB1型25個(gè)、CYB2型13個(gè)、CYB5型2個(gè)、CYB8型4個(gè)，CYB10、CYB11、CYB12是本研究新發(fā)現(xiàn)的基因型，分別有4個(gè)、3個(gè)、1個(gè)，其中標(biāo)本69是 CYB8型和新基因型的混合感染。
　?。?）將獲得的新基因型納入 GenBank，獲得登錄號(hào)。擴(kuò)大了我國(guó)用于 PJ分型的樣本量，為進(jìn)一步了解我國(guó) PJ的種群特征和進(jìn)化情況。

16、r>　　研究結(jié)論：
　　1.本研究結(jié)果表明 AIDS合并肺部感染的人群中運(yùn)用PCR診斷為 PCP的陽(yáng)性率高，提示在我國(guó)南方地區(qū)肺孢子菌肺炎仍然是 AIDS患者的常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染之一。
　　2.對(duì)于 PCP診斷的實(shí)驗(yàn)方法，PCR法比傳統(tǒng)的 GMS染色法的敏感性高，對(duì)樣本采集的要求低，優(yōu)點(diǎn)多，可以推廣用于 PCP的實(shí)驗(yàn)室診斷?？捎糜诜肿訖z測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查，并可為篩選 AIDS患者中PCP高風(fēng)險(xiǎn)人群提供參考依據(jù)。所用PJ-mtLS

17、U rRNA的引物對(duì) PJ高度敏感。序列分析結(jié)果表示該基因比較保守，突變少同源性大，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果基本一致，可以推廣用于我國(guó)肺孢子菌的檢測(cè)和流行病學(xué)等研究。
　　3.我國(guó)南方地區(qū) AIDS感染人群中肺孢子菌的基因具有多態(tài)性，其中mt LSUrRNA基因型在85和248的2個(gè)位點(diǎn)共分為5型。我國(guó)廣州地區(qū)該基因型的分布以基因型4型占首位，比例為34%；其次是基因型1型和基因型2型，比例均為23%。
　　4. ITS基因是分析

18、PJ基因多態(tài)性的良好位點(diǎn)。獲得53條序列，共14種組合序列，Eg是最常見(jiàn)基因型，其中“BTM4g、BTM1i”是新發(fā)現(xiàn)的組合型。
　　5. CYB基因型發(fā)現(xiàn)3種不同于原型序列的新序列，分別被命名為 CYB10型、CYB11型、CYB12型，沒(méi)有檢測(cè)到與文獻(xiàn)報(bào)道的藥物靶位基因的突變。
　　6.我國(guó)南方地區(qū) AIDS合并肺部感染人群中肺孢子菌 DHPS和DHFR基因型耐藥相關(guān)位點(diǎn)的突變率低，可能與廣州地區(qū)人群對(duì)于常見(jiàn)的上呼吸道感