人工合成肺孢子菌p55蛋白串聯(lián)基因的克隆表達及產物分析.pdf

1、目的： 肺孢子菌肺炎(Pneumosystis pneumonia PCP)，是由肺孢子菌引起的一種機會感染性致命性肺炎。常見于AIDS、惡性腫瘤、器官移植及其他免疫功能不全的人群，隨著艾滋病在世界各地的蔓延流行，器官移植的開展，免疫抑制劑的廣泛應用，肺孢子菌的機會性感染將成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此，國內外有許多學者致力于PCP防治策略以及疫苗方面的研究，但是至今尚無理想的防治措施問世。肺孢子菌55 kDa蛋白(p55)是

2、肺孢子菌的主要抗原成分之一，能刺激宿主產生抗肺孢子菌的保護性免疫反應。但是肺孢子菌體外培養(yǎng)困難而致p55抗原來源受限，多個p55蛋白變異體的出現又使免疫效果受到影響，這些都對利用p55抗原進行免疫防治研究十分不利。本實驗是通過網絡數據庫結合生物軟件分析的方法，分析p55蛋白可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用并具有較好抗原性參數的區(qū)域作為候選抗原表位，從5個p55蛋白變異體中共選取了十二個B細胞表位，將各表位進行串聯(lián)后形成嵌合體，人工合成串聯(lián)

3、基因后進行體外表達，為PCP疫苗的深入研究提供實驗依據。 方法： 一、抗原表位預測 運用生物信息學方法對p55蛋白的二級結構，親水性，穿膜螺旋，N-糖基化位點，氨基酸序列的親疏水性，表面可及性，分子柔韌性及抗原性參數進行預測分析，設計抗原表位多肽。 二、基因合成和測序鑒定 設計多表位的串聯(lián)基因，命名為TAG，由上海生工生物工程技術服務有限公 司合成及測序驗證。 三、TAG串聯(lián)基因原

4、核表達載體的構建及鑒定 將該TAG基因克隆到GST融合蛋白表達載體pGEX-6p-1上，構建重組質粒pGEX-6p-1/TAG，受體菌為E. coli DH5 α菌株。將該含有該重組質粒的菌株于37℃增菌，按照小量質粒提取試劑盒方法將過夜培養(yǎng)菌液提取質粒，應用限制性內切酶進行酶切，行瓊脂糖凝膠電泳。 四、TAG串聯(lián)基因的擴增及表達 將被證實的含有重組質粒pGEX-6p-1/TAG的E.coliDH5α，在LB液體

5、培養(yǎng)基中37℃增菌，IPTG誘導其表達，將菌體變性后進行8％SDS-PAGE電泳。 五、Western Blotting分析 將表達目的蛋白和陽性對照GST蛋白的菌液離心后進行超聲破菌，收集上清后100℃變性5min，8％SDS-PAGE電泳。45V，3h冰浴，轉移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉、0.1％BSA封閉2小時，以1:500稀釋濃度加入Anti-GST-Ab抗體，4℃過夜。PBST漂洗三次，加入HRP標記羊抗兔I

6、gG，室溫孵育2h，用DAB顯色，30min內觀察結果。 六、TAG表達蛋白的初步純化 提取包涵體，1、2、4、6M尿素充分振蕩、洗滌，將沉淀重懸含8M尿素的包涵體溶解緩沖液中于充分振蕩溶解包涵體后，4℃離心，收取上清，將沉淀用PBS重懸。將上清、沉淀作Western Blotting分析后，確定最好的洗滌濃度進行大量純化，以為下一步實驗做好準備。 結果： 一、抗原表位設計及基因合成 選取目前報道

7、的肺孢子菌p55蛋白的5個變異體當中有效抗原位點，共選取了十二個B細胞表位，將各表位進行串聯(lián)，人工合成串聯(lián)基因，全長1180bp，命名為TAG。 二、重組質粒的構建及鑒定 將串聯(lián)基因連接在原核表達載體pGEX-6p-1上，命名為pGEX-6p-1/TAG，該重組質粒經測序證明堿基序列及讀碼框架完全正確。此外該重組質粒用限制性內切酶BamHI，NotI消化，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳證實片段大小與預期吻合，質粒構建成功。

8、 三、TAG在原核細胞中表達 攜帶重組質粒pGEX-6p-1/TAG的E. coli DH5α經IPTG誘導表達后，8％SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白為分子量為69KD的GST融合蛋白，并出現于包涵體中。 四、Western Biotting印跡分析 分別攜帶質粒pGEX-6p-1/TAG和pGEX-6p-1的E.coli DH5α表達出分子量約69KD的GST-TAG融合蛋白和約26KD的GST蛋白。We

9、stern Blotting結果表明這兩個蛋白能被Anti-GST-Ab識別，重組TAG蛋白被成功表達。 五、重組TAG蛋白的初步純化 尿素法純化重組TAG蛋白顯示其最佳洗滌濃度為4M尿素，用8M尿素進行溶解可得較好效果。 結論： 本研究以生物信息學為基礎設計了肺孢子菌p55蛋白抗原表位的串聯(lián)基因，成功地建立了表達多表位串聯(lián)基因的原核表達系統(tǒng)。為進一步研制以該多表位串聯(lián)基因為基礎的疫苗研究奠定了良好的基礎