用于診斷孢子絲菌病的特異性探針和引物的篩選及孢子絲菌基因分型的比較.pdf

1、申克氏孢子絲菌是孢子絲菌病的致病菌，主要引起皮膚、皮下組織和附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染，偶可播散至骨骼和內臟，甚至發(fā)生全身的播散性感染。孢子絲菌病在世界范圍內廣泛分布。目前該病的診斷較為困難。已見文獻報道的孢子絲菌相對特異性引物和探針為孢子絲菌病的分子生物學診斷奠定了基礎，但尚無資料對各種引物和探針進行過系統(tǒng)地比較。真菌傳統(tǒng)的分型方法主要依賴菌體培養(yǎng)和鏡下的形態(tài)學觀察，而申克氏孢子絲菌具有“表型特征基本一致”的特點，因此，利用分子生

2、物學方法對其進行基因分型就顯示出一定的優(yōu)勢。曾用于申克氏孢子絲菌種內分型的分子生物學方法有隨機擴增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、mtDNA的限制性內切酶多態(tài)性分析(RFLP)及核糖體基因限制性內切酶多態(tài)性分析(rDNA RFLP)與Southern blotting雜交相結合等方法。本研究旨在以相同的孢子絲菌菌株為樣本，對以上3種方法進行比較，以確定在基因分型上哪種方法相關性更好、分辨力更強，并篩選出對孢子絲菌更敏感和更特異的探針和引物

3、，為從基因水平上快速、準確診斷孢子絲菌病奠定基礎。 材料與方法： 1．以50株純培養(yǎng)的孢子絲茵及標準株為樣本，以毛霉、煙曲霉、白色念珠菌各1株為陰性對照，通過對基因組DNA進行PCR擴增，對已見報道的4對孢子絲菌特異性引物進行篩選，引物分別為針對18SrRNA的SS3-SS4、幾丁質合成酶基因Ⅰ的S2-R2、拓撲異構酶基因Ⅱ的SSHF31-SSHR97及ITS Ⅱ區(qū)的ITS3-SSP。結果以PCR產(chǎn)物在1﹪瓊脂糖凝膠電泳

4、上出現(xiàn)與標準株同一水平的亮光帶型為陽性，對照菌株不出現(xiàn)陽性條帶的引物即為特異性引物。進一步對陽性的模板倍比稀釋，再以特異的引物進行PCR擴增，以DNA模板濃度最低且?guī)完栃哉邽楦禺?、更敏感的引物?2.菌株樣本同上，用PCR-ELISA的方法對已見報道的5個孢子絲菌特異性探針進行篩選，探針分別為針對28SrRNA的U26852、U26866、U26866’，針對18SrRNA的M85053及針對ITSⅡ區(qū)的AF11794.5。

5、底物顯色者為陽性，依據(jù)顯色強弱及光密度值大小進行定性定量分析，從而判斷探針的敏感性和特異性。 3.在本教研室先前進行的“rDNA RFLP．S0uthern blotting雜交”分型的基礎上，選擇與其相同的32株孢子絲菌為樣本，將菌株的mtDNA以限制性內切酶HaeⅢ酶切進行RFLP分型，同時以隨機引物OPAA11對菌株的基因組DNA PCR擴增進行RAPD分型，對電泳帶型進行分析，進一步對三種分型方法進行比較。 結果

6、： 1.在同樣PCR條件下，引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有較好的特異性，引物S2-R2的敏感性更高：4對引物對50株孢子絲菌均能擴增出陽性條帶；引物SS3-SS4對白念擴增條帶亦為陽性，特異性不強；同一模板濃度下引物SSHF31-SSHR97的敏感性不強。 2.在相同的雜交和ELISA條件下，50株孢子絲菌均對探針U26852顯色較強，對其它4個探針則顯色較弱。 3.mtDNA-

7、RFLP方法將32株受試菌株分為5型，分別對應日本學者Ishizaki、林俊萍等在研究世界各地孢子絲菌mtDNA-RFLP基因分型中所命名的1，4，6，7，20五種基因型；RAPD方法則將受試菌株分為7種基因型，且所有菌株均具有約0.6kbp大小的共有條帶；兩種方法在孢子絲菌的基因分型與南北方分布及臨床分型的聯(lián)系方面均未表現(xiàn)出明顯相關性。 結論： 1.針對幾丁質合成酶基因Ⅰ的引物S2-R2在目前已見文獻報道的孢子絲菌特異