腎上腺惡性腫瘤新型分子靶向治療的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分熱休克蛋白90抑制劑對(duì)惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的抑制作用
　　目的:研究HSP90在良惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中表達(dá)情況，觀(guān)察其抑制劑17-AAG和Ganetespib對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、凋亡及VEGF、HSP90、STAT3蛋白表達(dá)的影響;建立裸鼠嗜鉻細(xì)胞瘤移植瘤模型，研究HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對(duì)其作用;探討HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤治療的作用及分子機(jī)制。

2、
　　方法:免疫組織化學(xué)、Western Blot檢測(cè)HSP90在良、惡性嗜鉻細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況。不同濃度梯度的17-AAG和Ganetespib處理PC12細(xì)胞12h、24 h和48 h后采用MTT方法檢測(cè)HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib對(duì)PC12細(xì)胞增殖能力的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的HSP90抑制劑17-AAG和Ganetespib處理后對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響，及不同濃度Ganetespib處理后

3、對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響。Western blot檢測(cè)不同濃度的HSP90抑制劑Ganetespib處理對(duì)PC12細(xì)胞VEGF、HSP90、STAT3蛋白表達(dá)水平的影響。建立裸鼠嗜鉻細(xì)胞瘤移植瘤模型，通過(guò)測(cè)量裸鼠移植瘤體積和重量，病理學(xué)方法檢測(cè)腫瘤形態(tài)，免疫組織化學(xué)、Westernblot檢測(cè)腫瘤組織中HSP90、STAT3和ERBB2的表達(dá)，研究17-AAG、Ganetespib對(duì)腫瘤的影響。
　　結(jié)果:HSP90在惡性嗜鉻細(xì)胞

4、瘤中的蛋白表達(dá)水平高于良性嗜鉻細(xì)胞瘤，而正常腎上腺髓質(zhì)組織中HSP90表達(dá)水平最低，三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。17-AAG、Ganetespib對(duì)PC12細(xì)胞均有明顯的抑制增殖作用，并呈現(xiàn)劑量與時(shí)間的依賴(lài)性，其中17-AAG的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.05μmol/L。17-AAG可以有效促進(jìn)PC12細(xì)胞的凋亡，且具有時(shí)效關(guān)系;Ganetespib可以促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，使其細(xì)胞周期阻滯，且具有劑量相關(guān)性。Gane

5、tespib作用于PC12細(xì)胞24h后，可使HSP90、VEGF及STAT3蛋白表達(dá)明顯減少。成功建立裸鼠嗜鉻細(xì)胞瘤移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)17-AAG組、Ganetespib組與對(duì)照組比較，用藥組瘤體較小，差異明顯;處死裸鼠，取出腫瘤并稱(chēng)重，17-AAG組瘤體重3.29±0.57g，明顯低于對(duì)照組7.94±1.20g，抑瘤率為58.6％。
　　結(jié)論:HSP90表達(dá)水平與惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的生物學(xué)行為有關(guān)，HSP90抑制劑17-AAG、

6、Ganetespib能夠抑制移植瘤中HSP90、VEGF及STAT3的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，通過(guò)靶向抑制HSP90可能有助于對(duì)晚期惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的治療，從而提高患者生存時(shí)間，但這需要大樣本的臨床試驗(yàn)來(lái)證明。本研究可為HSP90抑制劑在后期的臨床應(yīng)用研究中提供一定的參考，為惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的分子靶向治療提供新的方法和思路。
　　第二部分mTOR抑制劑對(duì)惡性嗜鉻細(xì)胞瘤的作用機(jī)制
　　目的:通過(guò)應(yīng)用哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mam

7、malian target of rapamycin，mTOR)抑制劑依維莫司于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞系裸鼠移植瘤，并觀(guān)察其對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及裸鼠生存的影響，進(jìn)一步探討依維莫司對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤腫瘤生長(zhǎng)及抑制血管生成的作用及其機(jī)制，為嗜鉻細(xì)胞瘤分子靶向治療提供指導(dǎo)。
　　方法:將大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12接種于裸鼠腋窩皮下，2周后待移植瘤體積增加至合適大小，并將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃10mg/kg，實(shí)驗(yàn)組給予

8、依維莫司灌胃5mg/kg，處理四周后分別測(cè)量腫瘤的體積及生存時(shí)間;取腫瘤標(biāo)本后分別通過(guò)免疫組化及Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤組織中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:對(duì)照組裸鼠的平均生存時(shí)間為（25.3±2.4）天，實(shí)驗(yàn)組則為（37.8±4.6）天，并用Kaplan-Meier，Log-Rank方法分析并檢測(cè)兩組生存差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)照組裸鼠移植瘤

9、平均體積為（4340.67±794.07）mm3，實(shí)驗(yàn)組體積則為（1506.01±352.69）mm3，兩組移植瘤體積亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論: mTOR抑制劑依維莫司可以明顯抑制裸鼠腫瘤體積增加，并改善生存預(yù)后，而同時(shí)可以降低腫瘤組織中STAT3和VEGF的表達(dá)水平;提示未來(lái)依維莫司可以作為嗜鉻細(xì)胞瘤的分子靶向治療藥物。
　　第三部分STAT3與IGF2在腎上腺皮質(zhì)癌的表達(dá)與意義
　　目的:探討胰

10、島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子-3(signaltransducers and activators of transcription，STAT3)在腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)中的表達(dá)及其臨床意義，并用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，定量檢測(cè)微血管密度(microvesseldensity，MVD)的表達(dá)，結(jié)合臨床資料，探討它們?cè)谀I上腺皮質(zhì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及血管形成中的意義。
　　方法:選取上海瑞金醫(yī)院1986年到2

11、010年間手術(shù)切除且有完整臨床和病理資料的腎上腺皮質(zhì)腫瘤標(biāo)本44例，將標(biāo)本分為良性腎上腺皮質(zhì)腺瘤（良性組）20例，ACC（惡性組）24例。免疫組化標(biāo)記采用間接法，EnVisionTM+檢測(cè)系統(tǒng)。IGF-2和STAT3采用半定量計(jì)數(shù)法進(jìn)行評(píng)分，以細(xì)胞染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比例兩種指標(biāo)的積分之和作為判斷陽(yáng)性或陰性的依據(jù)，若兩種積分之和大于3分則表達(dá)為陽(yáng)性，小于或等于3分則為陰性。腫瘤內(nèi)MVD計(jì)數(shù):在低倍物鏡下選取高血管密度區(qū)，之后在高倍鏡(

12、×400)下計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)被CD34染成棕黃色的血管數(shù)，取其平均值作為該例腫瘤的MVD值。比較并分析良、惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤組織之間IGF-2和STAT3的高、低表達(dá)率及MVD的區(qū)別。
　　結(jié)果:免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，STAT3在ACC組中的表達(dá)為79.17％(19/24)，良性組中為20.00％(4/20)，兩者之間有極顯著性差異（P＜0.001）;IGF-2在ACC組中呈高表達(dá)(17/24，70.83％)，在良性組中表達(dá)較低(5

13、/20，25.00％)，IGF-2在ACC組中的表達(dá)與在良性組中的表達(dá)有顯著性差異（P=0.002）。MVD在ACC組中的表達(dá)為(84.70±12.44)，良性組中為(21.05±8.07)，兩者之間有顯著性差異(P＜0.001)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，STAT3的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)(rs=0.832，P＜0.001)，IGF-2的表達(dá)與MVD也呈正相關(guān)(rs=0.703，P=0.001)。
　　結(jié)論:IGF-2和