線粒體ND5基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系研究.pdf

1、目的： 1.分析線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)ND5基因序列。 2.探討線粒體ND5基因變異與2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)主要臨床指標(biāo)及其慢性并發(fā)癥之間的關(guān)系。 3.尋找診斷T2DM的分子靶標(biāo)。 方法： 1.根據(jù)1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集浙江籍漢族人群中確診為T2DM的無血緣關(guān)系的215名患者，詳細(xì)記錄每例患者的臨床資料

2、，包括姓名、性別、年齡、發(fā)病年齡、身高、體重、家族史、并發(fā)癥及主要生化指標(biāo)；同時(shí)收集132名年齡匹配的健康體檢者作為對照，排除高血壓、高脂m癥、腦血管病、糖尿病及家族史、口服葡萄糖耐量異常者。 2.提取全血基因組DNA；設(shè)計(jì)三對引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增mtDNAnd5；PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接進(jìn)行測序分析，與劍橋參考序列(revisedCambridgeReferenceSequence，rCRS)進(jìn)行比對，找出線粒體ND5基因

3、的核苷酸變異位點(diǎn)。 3.分析T2DM組ND5基因變異；比較T2DM組與對照組各個(gè)變異位點(diǎn)的發(fā)生率，探討ND5基因變異與T2DM的關(guān)系。 4.利用生物信息學(xué)軟件ClustalX及蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，從氨基酸變異情況、蛋白結(jié)構(gòu)分析ND5基因變異；結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析ND5基因變異與T2DM及其慢性并發(fā)癥的相關(guān)性。 結(jié)果： 1.T2DM患者組和對照組的線粒體DNAnd5與劍橋參考序列比對存在著大量的基因變異，具有線

4、粒體基因的多態(tài)性。在215例T2DM患者中發(fā)現(xiàn)線粒體DNAnd5有103個(gè)變異位點(diǎn)，132名對照中存在56個(gè)變異位點(diǎn)，其中32個(gè)位點(diǎn)既存在于T2DM患者組又存在于對照組中。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，這些變異在兩組間的分布并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測大部分是一些多態(tài)性改變。 2.T2DM患者組中檢測到31個(gè)錯(cuò)義突變其中18個(gè)已有報(bào)道，72個(gè)同義突變中40個(gè)已有報(bào)道。有些錯(cuò)義突變位于ND5基因高度保守位置，并導(dǎo)致了氨基酸極性的變化。利用蛋白質(zhì)生物學(xué)分析

5、軟件分析ND5基因的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)位于高度保守位置的T12338C和A12634G變異使ND5亞單位的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，另有11個(gè)相對保守位置的氨基酸改變亦使ND5亞單位的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。 3.將T2DM患者中有mtDNAND5基因變異的患者分為有家族史組和無家族史組：T12338C、G13708A兩變異位點(diǎn)的變異率遠(yuǎn)高于無家族史組，其他變異位點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有家族史組女性患者發(fā)病率高、發(fā)病早、低密度脂蛋白(LDL-c)、糖化

6、血紅蛋白(HbAlc)與空腹血糖(FBG)明顯高于無家族史組，并且更容易引起視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變以及腎病等微血管并發(fā)癥。 4.將T2DM患者分為肥胖組與非肥胖組：C12717T、A13842G兩個(gè)變異位點(diǎn)在兩組之間的分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)非肥胖組：有糖尿病家族遺傳傾向；HbAlc、FBG、P2BG等均明顯高于肥胖組；FINS、P2INS低于肥胖組；TC、TG等生化指標(biāo)肥胖組高于非肥胖組人群，非肥胖組并

7、發(fā)視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變以及酮癥等微血管并發(fā)癥的機(jī)率明顯高于肥胖組。 5.根據(jù)T2DM慢性并發(fā)癥(高血壓、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變和腎病)發(fā)生情況，對有變異的207例患者分別進(jìn)行分組以及臨床資料的分析，發(fā)現(xiàn)病程、BMI、HbAlc、FBG、PINS和TC、TG在不同的分組間差異有顯著性。A13263G位點(diǎn)僅出現(xiàn)在高血壓組。糖尿病并發(fā)腎病，視網(wǎng)膜病變，周圍神經(jīng)病變?nèi)唛g有密切關(guān)系，三者均為糖尿病微血管并發(fā)癥，這三者之間相互作用，

8、相互影響。 6.T12338C突變使ND5基因起始位置的甲硫氨酸替換為蘇氨酸，在T2DM組與對照組之間的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，該位點(diǎn)變異使ND5蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；T2DM患者有家族聚集傾向。 結(jié)論： 1.線粒體ND5基因存在大量變異，以堿基轉(zhuǎn)換的點(diǎn)突變形式為主，推測大部分為線粒體DNA的多態(tài)性變異。 2.C12717T可能會增加2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而A13842G在肥胖者中患有2型糖尿病的可能性更大。