線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　 1.通過病例-對照和基于家系的研究方法分析2型糖尿病患者和對照組人群線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性的發(fā)生情況，探討線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性與2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)的相關(guān)性。
　　 2.分析線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性與T2DM慢性并發(fā)癥之間的相關(guān)性，為T2DM及其并發(fā)癥的遺傳危險因素評估提供參考。
　　 3、分析線粒體DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性在家系中的

2、分布情況以及與臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系，以進(jìn)一步驗(yàn)證DNA多態(tài)性位點(diǎn)異質(zhì)性與T2DM之間的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1、標(biāo)本采集:(1)散發(fā)病例對照根據(jù)美國糖尿病學(xué)會2007版糖尿病診療標(biāo)準(zhǔn)，選取2010年4月-2011年2月溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院確診為T2DM的無血緣關(guān)系的患者402例（浙江籍漢族人群），排除了1型糖尿病、LADA以及其他原因引起的繼發(fā)性血糖升高如Cushing綜合癥、巨人癥等。同時收集具有母系遺傳特征的

3、糖尿病家系。對所有T2DM患者做常規(guī)生化指標(biāo)檢測并記錄其基本臨床資料（包括姓名、性別、年齡、病程、胰島素使用情況、慢性并發(fā)癥、家族史等）。對照組來自2010年11月-2010年12月溫州市體檢中心的體檢者，包括417例年齡匹配的健康體檢者、30例只合并肥胖者、31例只合并脂代謝紊亂者、25例只合并高血壓者。健康體檢者排除糖尿病及家族史者、口服葡萄糖耐量異常、以及高血壓、脂代謝紊亂、腦血管病等代謝性疾病。只合并肥胖者是根據(jù)2000年亞太地

4、區(qū)肥胖的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為肥胖者，同時排除了糖尿病及家族史者、口服葡萄糖耐量異常、以及高血壓、脂代謝紊亂、腦血管病等代謝性疾病;只合并脂代謝紊亂者是空腹血TG≥1.7mmol/l(150mg/dl)，及（或）空腹HDL-C＜0.9 mmol/l(35mg/dl)（男）或＜1.0 mmol/l(39mg/dl)（女），同時排除了糖尿病及家族史者、口服葡萄糖耐量異常、肥胖、以及高血壓、腦血管病等代謝性疾病;只合并高血壓者是根據(jù)2005年修訂版《

5、中國高血壓防治指南》診斷為高血壓者，同時排除了糖尿病及家族史者、口服葡萄糖耐量異常、肥胖、脂代謝紊亂、腦血管病等代謝性疾病。以上所有研究對象均簽署知情同意書，完成流行病學(xué)調(diào)查和提供血液標(biāo)本。(2)家系a、b以2010年-2011年間在溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診確診為2型糖尿病且有家族史的患者Ⅲ-1和Ⅱ-17為先證者，采用統(tǒng)一的家系調(diào)查表對其家系進(jìn)行調(diào)查，內(nèi)容包括一般情況、系譜圖（圖4）、T2DM病史，測量血壓、身高、體重、血糖等。

6、>　　 2、提取所有受試者全血基因組DNA，采用PCR擴(kuò)增ND2基因內(nèi)能定義單倍型類群N9a2c的區(qū)段(5255-5511)，直接測序后與劍橋參考序列(revised CambridgeReference Sequence，rCRS)進(jìn)行比對，根據(jù)測序峰圖，對可能存在的異質(zhì)性變異采用變性高效液相色譜（denaturing high performance liquidchromatography，DHPLC）技術(shù)證實(shí)。
　　

7、3、應(yīng)用DNAstar軟件包中的Seqman和Condon code Aligner軟件將測序結(jié)果與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列(revised Cambridge Reference Sequence，rCRS)進(jìn)行比對，分析ND2基因內(nèi)能定義單倍型類群N9a2c的區(qū)段(5255-5511)的變異，并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法分析該區(qū)段位點(diǎn)變異與T2DM及其慢性并發(fā)癥的相關(guān)性。
　　 4、對線粒體單倍型類群N9a2c進(jìn)行家系分析。
　　 結(jié)果:<

8、br>　　 1、在402例2型糖尿病患者中檢測出39例攜帶有G5471A、A5474G、A5498G變異，503例對照組人群中檢出6例G5471A、A5474G、A5498G變異，且這三個位點(diǎn)均存在異質(zhì)性現(xiàn)象。其中，在417例健康對照中未發(fā)現(xiàn)G5471A、A5474G、A5498G變異，在30例只合并肥胖的對照中發(fā)現(xiàn)2例G5471A、A5474G、A5498G變異，在31例只合并脂代謝紊亂的對照中發(fā)現(xiàn)2例G5471A、A5474G、A

9、5498G變異，在25例只合并高血壓的對照中發(fā)現(xiàn)2例G5471A、A5474G、A5498G變異。G5471A、A5474G、A5498G變異在T2DM組、肥胖組、脂代謝紊亂組、高血壓組中的發(fā)生率與健康對照組比較差異有顯著性(p＜0.05)。
　　 2、在兩例具有母系遺傳傾向的家系調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)G5471A、A5474G、A5498G同時出現(xiàn)的異質(zhì)性現(xiàn)象。
　　 3、根據(jù)有無G5471A、A5474G、A5498G變異將T

10、2DM患者進(jìn)行分組，分為肥胖組和非肥胖組，有無微血管并發(fā)癥，大血管并發(fā)癥，高血壓等，分析結(jié)果顯示BMI、收縮壓水平在G5471A、A5474G、A5498G變異組明顯高于非變異組(p＜0.05)，高血壓病的發(fā)病率在G5471A、A5474G、A5498G變異組也明顯高于非變異組(p＜0.05)。
　　 4、在對G5471A、A5474G、A5498G變異與糖尿病慢性并發(fā)癥的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，G5471A、A5474G、A5498

11、G在合并高血壓組中的發(fā)生率明顯高于未合并高血壓組，在其他并發(fā)癥分組中的差異無顯著性。
　　 結(jié)論:
　　 1、異質(zhì)性變異G5471A、A5474G、A5498G在T2DM組中的發(fā)生率明顯高于對照組，同時發(fā)現(xiàn)G5471A、A5474G、A5498G三個位點(diǎn)的變異存在異質(zhì)性。在兩個具有母系遺傳傾向的家系中也發(fā)現(xiàn)了G5471A、A5474G、A5498G三個異質(zhì)性變異位點(diǎn)。推測異質(zhì)性變異G5471A、A5474G、A5498G

12、及其所定義的線粒體單倍型類群N9a2c可能會提高個體患2型糖尿病的風(fēng)險。
　　 2、異質(zhì)性變異G5471A、A5474G、A5498G在肥胖組、脂代謝紊亂組、高血壓組中的發(fā)生率與健康對照組比較差異有顯著性，提示異質(zhì)性變異G5471A、A5474G、A5498G所定義的單倍型類群N9a2c可能與體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)。
　　 3、G5471A、A5474G、A5498G變異在合并高血壓組中的發(fā)生率明顯高于未合并高血壓組，在其他并