基于脫細(xì)胞心臟支架的三維心肌組織化模型體外構(gòu)建、評(píng)價(jià)及優(yōu)化.pdf

1、目的:冠心病(CHD)是引起心血管疾病(CVD)患者死亡的重要原因之一，心臟移植是終末期心臟病患者的首選治療方法。心臟組織工程目前發(fā)展迅速，其最終目的是體外再造心臟，然而目前尚有許多難題待解決，如支架材料的制備以及種子細(xì)胞的選擇。近年來具備天然三維結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞支架及體外可誘導(dǎo)分化的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在心臟組織工程研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。本研究旨在優(yōu)化脫細(xì)胞心臟支架的制備方法，體外構(gòu)建基于脫細(xì)胞心臟支架的三維心肌組織化模型，探

2、索脫細(xì)胞心臟支架及BMSCs在心臟組織工程中潛在應(yīng)用價(jià)值，以期將其應(yīng)用于CHD患者的治療及臨床藥理的研究。
　　方法:本研究通過聯(lián)合應(yīng)用十二烷基硫酸鈉(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-x100)對(duì)大鼠心臟行逆行主動(dòng)脈灌流制備脫細(xì)胞心臟支架。采用細(xì)胞核染色、HE染色、DNA含量檢測以及掃描電鏡(SEM)對(duì)制備的脫細(xì)胞心臟支架進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶及膠原酶分離原代心肌細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫熒光染色的方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。通

3、過添加10μM5-氮雜胞苷(5-azacytidine)誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞定向分化。同時(shí)，分別選取新生大鼠心肌細(xì)胞及BMSCs作為種子細(xì)胞體外構(gòu)建三維心肌組織化模型。采用倒置顯微鏡及免疫熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察支架上細(xì)胞生長狀態(tài)。結(jié)合旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器(RCCS)實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，分別采用活-死細(xì)胞染色、HE染色、SEM及實(shí)時(shí)定量PCR檢測對(duì)此三維(3D)培養(yǎng)體系進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:脫細(xì)胞心臟支架大體呈半透明囊狀。HE染色及SEM觀察

4、示支架呈多孔網(wǎng)狀或束狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核染色未見細(xì)胞核殘留。進(jìn)一步行DNA含量檢測示正常心臟組織DNA含量為229.35±0.06ng/mg，而脫細(xì)胞心臟支架DNA含量僅為1.64±0.03ng/mg，其含量明顯低于正常心臟組織。新生大鼠心肌細(xì)胞在分離培養(yǎng)24h后開始出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)，培養(yǎng)至72h細(xì)胞連接成片出現(xiàn)同步搏動(dòng)。細(xì)胞免疫熒光染色示分離純化的心肌細(xì)胞能夠表達(dá)心肌細(xì)胞特異性功能蛋白α-actinin以及troponin I。基于新生大鼠心肌

5、細(xì)胞構(gòu)建的三維培養(yǎng)模型經(jīng)活-死細(xì)胞染色及HE染色觀察示三維培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞生長狀態(tài)良好，未見明顯死細(xì)胞，細(xì)胞主要黏附生長于支架表面?；贐MSCs構(gòu)建的三維培養(yǎng)模型經(jīng)熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察、HE染色及SEM檢測示細(xì)胞沿支架纖維生長，增殖迅速并逐漸形成類組織塊樣結(jié)構(gòu)。RCCS動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下細(xì)胞更易生長入支架內(nèi)部。實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后BMSCs轉(zhuǎn)錄因子Gata4的表達(dá)水平顯著提高。將BMSCs與脫細(xì)胞心臟支架復(fù)合，培