絲素蛋白-殼聚糖三維多孔支架材料的構(gòu)建表征與細胞學(xué)體外實驗研究.pdf

1、骨組織工程是應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的基本原理和技術(shù)，再生新的骨組織，用以修復(fù)骨組織病變或缺損。其基本思路是將特異性成骨細胞種植于具有一定生物特性的并在人體內(nèi)可逐漸降解吸收的支架材料上，經(jīng)體外培養(yǎng)形成細胞生物材料復(fù)合物，然后將復(fù)合物植入人體的骨組織缺損部位，在細胞不斷增殖并分泌基質(zhì)的同時，支架材料逐步降解被人體吸收，最終形成新的具有與原功能和形態(tài)相似的骨組織[1]。
　　 骨組織工程是近年來最受關(guān)注的領(lǐng)域之一，它在解決由于創(chuàng)傷、感染

2、、腫瘤等原因所造成的骨缺損這一問題上具有很大的優(yōu)勢。在骨組織工程三要素:種子細胞、生長因子、支架材料中[2]，支架材料是骨組織工程的關(guān)鍵，它不僅將種子細胞和生長因子運送至缺損區(qū)，還給新生骨組織提供支撐作用。目前，支架材料是骨組織工程中的研究熱點，尤其是復(fù)合支架材料。絲素蛋白和殼聚糖都是天然高分子材料，具有良好的生物特性及獨特的機械特性，成為近年來較熱門的組織工程學(xué)材料。
　　 本試驗將一定濃度的絲素蛋白溶液和殼聚糖溶液以不同質(zhì)量

3、比例相混合，通過數(shù)次冷凍干燥合并化學(xué)交聯(lián)的方法制備出具有一定強度的多孔性支架，對其微觀結(jié)構(gòu)及相關(guān)的性能進行初步研究，篩選出適合成骨細胞生長的理想支架材料，為今后的骨缺損修復(fù)改建打下實驗基礎(chǔ)。
　　 第一部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的構(gòu)建及結(jié)構(gòu)表征的研究
　　 目的：
　　 通過冷凍干燥合并化學(xué)交聯(lián)的方法，制備出各種不同組分的絲素蛋白及殼聚糖的復(fù)合支架材料，對其材料結(jié)構(gòu)表征進行分析。
　　 方法：<

4、br>　　 通過CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1:2∶8（摩爾比）溶解體系溶解、過濾、濃縮提純制備出濃度為2％的絲素蛋白溶液，殼聚糖溶解于乙酸溶液配制成3％殼聚糖溶液，將二者溶液按不同質(zhì)量比混勻后，經(jīng)數(shù)次冷凍干燥以及浸泡交聯(lián)后，制得成品支架材料，采用電鏡觀察形貌，計算孔隙率并對支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行紅外光譜分析(FTIR)、X射線衍射表征(XRD)、EDS電子能譜分析。
　　 結(jié)果：
　　 絲素蛋白/殼聚糖(SF/CS

5、)內(nèi)部為三維多孔支架，尤以40％絲素蛋白-60％殼聚糖(40％SF-60％CS)組支架材料，以其適合成骨細胞直徑的孔徑大小有望成為骨組織工程中的優(yōu)良支架材料，且孔隙率保持在90％以上。本實驗也通過紅外圖譜分析、X射線衍射分析和能譜分析，闡釋了二者混合后內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，證實了二者互為改性的試驗方法是穩(wěn)定且成功的。
　　 第二部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的理化性能及降解試驗的研究
　　 目的：
　　 對不同組

6、分配比的SF/CS支架材料的吸水率、溶脹率進行研究，篩選出最佳配比的組分，然后進行該最佳組分的降解試驗，觀察是否具有良好的降解率以適應(yīng)生物材料在體內(nèi)的降解時間，以及降解液的pH值范圍是否適合體內(nèi)進行新陳代謝活動。
　　 方法：
　　 制備出各個不同組分支架材料（同第一部分），通過固態(tài)支架材料浸入水中所吸收水的重量對其浸水前實測重量的百分率計算吸水率，而將固態(tài)的支架材料浸入水等溶劑液體時，濕態(tài)較其干態(tài)的體積變化的比率計算溶

7、脹率。綜合以上試驗結(jié)果，得到最優(yōu)配比組為40％SF-60％CS組。將其置入人工體液(SBF)，進行為期64天的降解試驗，檢測絲素蛋白/殼聚糖(SF/CS)支架材料的降解速率以及降解液pH值的變化。
　　 結(jié)果：
　　 各組質(zhì)量配比的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料均具有良好的吸水率，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)組間差異不顯著(P＞0.05)，但溶脹率隨著絲素蛋白含量的增多而減小，在純殼聚糖組，溶脹率接近80％，與其他各組有顯著區(qū)別(P＜0

8、.05），而20％SF-80％CS組和40％SF-60％CS組的溶脹率略高于60％SF-40％CS組和80％SF-20％CS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但20％SF-80％CS組和40％SF-60％CS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 綜合以上各項實驗結(jié)果，篩選出40％SF-60％CS組支架材料為最優(yōu)組合，在本實驗中對40％SF-60％CS組也進行了為期為64天的體外降解試驗，發(fā)現(xiàn)降解速率相對比較平穩(wěn)，最

9、初的前15天里，降解速率很快，支架材料失去了14.43％的原始重量，而在接下去的21天里，降解速率開始減慢，而在以后的28天里，降解速率變得更慢，直到64天時，支架材料僅失去了18.25％的原始重量。然而降解液pH值在長達2個月的降解時間里，一直在7.42～7.62這一狹小的范圍內(nèi)波動，接近中性，這與體內(nèi)微環(huán)境的pH值相適應(yīng)，以上試驗結(jié)果表明該支架材料可用于在生物體內(nèi)。
　　 第三部分絲素蛋白/殼聚糖三維多孔支架材料的生物相容性

10、及成骨性能的細胞學(xué)實驗研究
　　 目的：
　　 在體外實驗中，探討40％SF-60％CS組支架材料與成骨細胞MG-63的生物相容性以及對MG-63細胞的成骨功能影響。
　　 方法：
　　 實驗分組:因為純絲素蛋白(100％SF)支架材料松脆，水溶液中溶失特別高，不能在水溶液中穩(wěn)定存在，故實驗組只設(shè)為:純CS組(100％CS)和40％SF-60％CS組，而空白對照組:載玻片組。
　　 將對數(shù)生長期的

11、成骨細胞MG-63接種于各組材料上后，通過Hoechst熒光染色觀察其在材料上的生長情況，計算黏附率和增殖率，最后通過MG-63細胞分泌堿性磷酸酶(ALP)的活性及礦化結(jié)節(jié)的形成來研究支架材料的成骨性能。采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件做統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計學(xué)方法采用析因方差分析，為了對每一時間段組間進行比較，采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 MG-63細胞在支架

12、上的生長情況良好，接種6小時后，可見細胞已經(jīng)開始黏附于支架材料的壁上，接種24小時后，大部分細胞黏附完畢，3天后，各細胞之間聯(lián)合緊密，支架材料孔壁及孔隙內(nèi)已長滿細胞。
　　 早期黏附率結(jié)果為，兩組實驗組均顯著優(yōu)于空白對照組載玻片組(P＜0.05)，在1h，3h，6h這三個時間點里，材料上的細胞數(shù)目是逐漸增多的，在1h和3h這兩個時間點，兩組實驗組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在6h時，兩組黏附率均接近75％，差異無統(tǒng)計學(xué)

13、意義（P＞0.05）。
　　 兩組實驗組支架上的MG-63細胞增殖率顯著高于空白對照組載玻片組。在第1天和第5天時，兩組實驗組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而在第3天時，兩組實驗組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　 兩組實驗組材料對MG-63細胞分泌堿性磷酸酶均有促進作用，與空白對照組相比差異具有顯著性意義(P＜0.05)。兩組實驗組相比較，發(fā)現(xiàn)支架材料與MG-63共培養(yǎng)的7d，14d，21d里，差異均有顯著

14、性（P＜0.05），其中40％SF-60％CS組優(yōu)于100％CS組。
　　 Hoechst染色結(jié)果表明MG-63細胞在40％SF-60％CS組支架材料上具有良好的活性，且具有一定的增殖能力。而在礦化研究中也發(fā)現(xiàn)，無論是細胞團聚還是基質(zhì)分泌以及最后的鈣化結(jié)節(jié)形成，40％SF-60％CS組支架材料均優(yōu)于100％CS組支架材料。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.將濃度為2％絲素蛋白溶液與3％殼聚糖溶液相混合，互為改性，冷凍

15、干燥后能制備出各組不同組分的支架材料，通過紅外分析和xrd分析結(jié)果也印證了共混后材料結(jié)構(gòu)的微觀性能發(fā)生改變，使其不穩(wěn)定的α螺旋/無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向較為穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，且結(jié)晶程度也增強。其中40％SF-60％CS組，具有適合成骨細胞生長的較佳孔徑，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而成為細胞支架的首選配比。
　　 2.各組絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架材料均具有良好的吸水率，但溶脹率隨著絲素蛋白含量的增多而減小，綜合以上各條件，也篩選出40％SF-60％

16、CS組為最優(yōu)組合，對該組進行64天的體外降解試驗，發(fā)現(xiàn)降解速率相對比較平穩(wěn)，降解液pH值接近中性。這與體內(nèi)微環(huán)境的pH值相適應(yīng)，這利于該支架材料在生物體內(nèi)利用。
　　 3.40％SF-60％CS組支架材料有利于MG-63細胞的早期黏附、生長、增殖，這說明經(jīng)過改性的40％SF-60％CS組支架材料有良好的生物相容性以及較佳的細胞親和力，并且可以促進成骨細胞較旺盛的分泌細胞基質(zhì)，是一種較好的骨組織工程材料，對將來能用于骨組織工程的研