體外構(gòu)建血管化組織工程心肌的研究.pdf

1、目的：本研究用5-氮胞苷對(duì)獲取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基 MV2（EGM-2MV）對(duì)獲取的骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)獲取的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以2:1比例混合種植于Matrigel基質(zhì)膠上，進(jìn)行組織工程心肌的血管化，以探索在體外進(jìn)行血管化組織工程心肌構(gòu)建的可能性。
　　方法：1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及誘導(dǎo)：利用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法分離獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；5-氮胞苷作為誘導(dǎo)劑，對(duì)其向心肌細(xì)胞進(jìn)行定

2、向誘導(dǎo)。誘導(dǎo)前后，免疫細(xì)胞化學(xué)法行細(xì)胞鑒定：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29、CD44、CD34；心肌細(xì)胞表面標(biāo)志物 cTnT。2、骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及向內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)：取3周齡SD大鼠，分離出股骨、脛骨，等量淋巴細(xì)胞分層液分離，收集單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò) EGM-2MV條件培養(yǎng)基對(duì)骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)CD31、CD34和CD133等表面標(biāo)志物的表達(dá)情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3、體外構(gòu)建組織工程化心肌：將骨髓源性心肌細(xì)胞

3、用DAPI標(biāo)記、骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞用 CM-dil標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)組以2:1比例種植于 Matrigel基質(zhì)膠并進(jìn)行共同培養(yǎng)；對(duì)照組以1:0的比例進(jìn)行種植培養(yǎng)。不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞復(fù)合體的形態(tài)，免疫熒光顯微鏡下和蘇木精-伊紅染色方法觀察兩種細(xì)胞的分布情況并進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料選用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間對(duì)比采用t檢驗(yàn)，P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、骨髓間充質(zhì)干

4、細(xì)胞原代細(xì)胞接種后少數(shù)細(xì)胞貼壁，形狀不規(guī)則，可呈多種形態(tài)，如：紡錘形、不規(guī)則形；之后細(xì)胞形態(tài)不斷變化，最終呈集落樣增殖，細(xì)胞呈梭形并以放射狀或者漩渦狀形態(tài)向四周擴(kuò)增。細(xì)胞傳代后，混合雜細(xì)胞被清除，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分布均勻，形態(tài)單一，呈長(zhǎng)梭形，且增殖明顯高于原代細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44陽(yáng)性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)。即胞漿中有棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，反之為陰性。2、P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀況：接種第2天因胰酶消化作

5、用及適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境細(xì)胞數(shù)稍有減少；第3天開(kāi)始細(xì)胞數(shù)有所增長(zhǎng)；到了第6天，細(xì)胞數(shù)明顯開(kāi)始升高，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞處于分裂增殖期；第9天時(shí)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到最多。3、獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在心肌細(xì)胞的定向誘導(dǎo)過(guò)程的初期（24h后）部分細(xì)胞因5-氮胞苷的毒性作用而死亡，經(jīng)過(guò)1周的藥物誘導(dǎo)后可出現(xiàn)臨近細(xì)胞彼此融合；2周后，細(xì)胞呈圓柱形或多角形，細(xì)胞接觸緊密；4周后，細(xì)胞呈梭形，漩渦狀生長(zhǎng)。誘導(dǎo)后細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示 cTnT陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，確

6、定誘導(dǎo)后細(xì)胞的陽(yáng)性率在90％以上。4、分離培養(yǎng)的大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞接種后細(xì)胞逐漸貼壁，呈小桿狀或梭形等多種形態(tài)。5天時(shí)為集落樣生長(zhǎng)：中央細(xì)胞密集，周圍單層細(xì)胞放射狀羅列，2周時(shí)多數(shù)單層細(xì)胞為多角形，融合成片狀，呈所謂“鋪路石樣”外觀。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示 CD31、CD34和CD133陽(yáng)性表達(dá)。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定誘導(dǎo)后細(xì)胞的陽(yáng)性率在90%以上。5、第3代內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：接種第2天因胰酶消化作用及適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)增多，

7、48小時(shí)后貼壁伸展，3天后開(kāi)始大量增殖，5天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)明顯增多，8天以后增長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸減緩，趨于平穩(wěn)。6、蘇木精-伊紅染色及熒光顯微鏡顯示心肌內(nèi)皮細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠復(fù)合體內(nèi)細(xì)胞密度均勻，心肌細(xì)胞胞核呈藍(lán)色圓形熒光，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿呈紅色熒光。7、心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，2:1組復(fù)合體可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞典型的“成血管現(xiàn)象”；1:0組可見(jiàn)細(xì)胞均勻生長(zhǎng)，卻無(wú)“成血管現(xiàn)象”。8、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示2:1組比1:0

8、組的凋亡心肌細(xì)胞少。9、通過(guò)血管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，心肌內(nèi)皮細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠組（12±2.69）形成的血管樣結(jié)構(gòu)明顯多于心肌細(xì)胞/Matrigel基質(zhì)膠組（1±0.79）。
　　結(jié)論：1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)5-aza誘導(dǎo)可以獲得陽(yáng)性率較高的心肌細(xì)胞。2、等量淋巴細(xì)胞分層液分離獲取骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞并用 EGM-2MV條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，可以獲得活性好、陽(yáng)性率高的骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞。3、骨髓源性心肌細(xì)胞與骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞以2:1