雌、孕激素對(duì)小鼠子宮巨噬細(xì)胞數(shù)量、分布的影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、[研究背景]
　　 子宮是胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育的部位。巨噬細(xì)胞(macrophage，M￠)來源于血液中的單核細(xì)胞，是子宮的一種常駐免疫細(xì)胞，參與子宮局部免疫應(yīng)答、免疫效應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)，對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能，尤其是妊娠的建立和維持有著重要的作用。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)人和嚙齒類動(dòng)物正常月經(jīng)周期/動(dòng)情周期、妊娠期子宮巨噬細(xì)胞的密度和時(shí)空分布方式、遷移、分化及激活的調(diào)控及其分泌功能的探討均提示巨噬細(xì)胞的功能和分布可能直接或間接的受到卵巢甾體性激素——雌

2、孕激素的調(diào)控。雌、孕酮是妊娠建立和維持過程中起重要作用的激素。雌激素可使子宮內(nèi)膜增生增厚，有助于提高子宮內(nèi)膜對(duì)植入的敏感性，是啟動(dòng)胚胎著床的重要條件。孕酮在非妊娠期間由黃體細(xì)胞分泌，可使處于增生期的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為分泌期，為受精卵的生存和著床提供適宜的環(huán)境。子宮內(nèi)膜達(dá)到容受狀態(tài)是成功妊娠的關(guān)鍵因素之一，此時(shí)子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成及基因的表達(dá)等在雌孕激素的調(diào)節(jié)下均發(fā)生改變并且在時(shí)間和空間上達(dá)到高度的協(xié)調(diào)一致。目前，大量臨床研究報(bào)道在體外受精

3、-胚胎移植周期(IVF-ET)中過高的雌激素水平及孕激素水平對(duì)子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生影響，降低臨床妊娠率。而圍著床期子宮巨噬細(xì)胞數(shù)量和分布有著高度的時(shí)間和空間特異性，對(duì)子宮內(nèi)膜容受性有著重要影響，圍著床期巨噬細(xì)胞數(shù)量、活性及表型異常均可降低子宮內(nèi)膜容受性。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于雌、孕激素對(duì)子宮巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究已有多項(xiàng)報(bào)道，但是研究的結(jié)果有所不同，其機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。關(guān)于超生理水平及生理水平雌激素或孕激素對(duì)子宮巨噬細(xì)胞的影響國(guó)內(nèi)亦未見報(bào)道。因此本研究

4、采用雙側(cè)卵巢切除小鼠模型（去勢(shì)小鼠），外源性補(bǔ)充生理劑量及超生理劑量的雌激素或孕激素，研究雌、孕激素對(duì)子宮巨噬細(xì)胞數(shù)量、分布及功能的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，從而為進(jìn)一步了解巨噬細(xì)胞在生殖生理學(xué)、生殖免疫學(xué)的作用，為解決生殖醫(yī)學(xué)臨床上迫切需要解決的著床障礙、器官移植提供新思路，為尋找和開發(fā)主動(dòng)干預(yù)的免疫學(xué)新途徑提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　 [目的]
　　 建立雙側(cè)卵巢切除小鼠模型，分別從組織和細(xì)胞水平上，研究外源性補(bǔ)

5、充不同濃度雌二醇和孕酮后小鼠子宮組織局部巨噬細(xì)胞的分布、數(shù)量和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)表達(dá)量的變化，探討雌、孕激素對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)量和分布的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　 [方法]
　　 取性發(fā)育成熟的雌鼠（體重30±2g）行雙側(cè)卵巢切除術(shù)（去勢(shì)小鼠），術(shù)后第17天分別皮下注射生理劑量雌二醇（100ng/只）、超生理劑量雌二醇(1000ng/只)、生理劑量孕酮（2mg/只）、超生理劑量孕酮（20mg/只）0.1ml

6、及芝麻油0.1ml（陰性對(duì)照組），未給予干預(yù)的去勢(shì)小鼠作為空白對(duì)照組。分別于給藥后6h、24h取子宮標(biāo)本，利用 HE染色觀察組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化;利用免疫組織化學(xué)方法定量研究不同濃度雌二醇、孕酮作用后各時(shí)間點(diǎn)子宮巨噬細(xì)胞數(shù)量、分布和M-CSF表達(dá)量的變化。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)小鼠子宮形態(tài)學(xué)觀察、陰道脫落細(xì)胞特征變化觀察以及外周血雌孕激素測(cè)定結(jié)果示小鼠去勢(shì)后子宮明顯萎縮、外陰及陰道脫落細(xì)胞失去周期性變化，呈動(dòng)

7、情間期樣改變、血中雌孕激素水平較正常小鼠顯著降低。上述結(jié)果提示去勢(shì)小鼠模型成功建立。
　　 (2)免疫組織化學(xué)顯示:空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組F4/80+巨噬細(xì)胞數(shù)量極少，僅在子宮內(nèi)膜基底部與肌膜交界處、肌膜和外膜零星可見;陰性對(duì)照組6h、24h子宮內(nèi)膜、肌膜及外膜巨噬細(xì)胞數(shù)量與空白對(duì)照組無顯著差異。與陰性對(duì)照組相比，外源性補(bǔ)充100ng、1000ng雌激素組給藥后6h、24h子宮巨噬細(xì)胞數(shù)較陰性組均顯著增加(P分別為0.000、0

8、.003)。100ng、1000ng雌激素組給藥后6h子宮巨噬細(xì)胞數(shù)與24h相比無顯著差異（P分別為0.499、0.225）。對(duì)子宮各層巨噬細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析:補(bǔ)充100ng及1000ng雌激素后6h、24h，子宮巨噬細(xì)胞分布未發(fā)現(xiàn)顯著差異，即補(bǔ)充后6h子宮內(nèi)膜、肌膜、外膜巨噬細(xì)胞數(shù)與陰性組相比顯著增加;24h后子宮肌膜及外膜巨噬細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比顯著增加，內(nèi)膜巨噬細(xì)胞無顯著差異。
　　 (3)免疫組織化學(xué)顯示:與陰性對(duì)照組相比，

9、外源性補(bǔ)充孕酮2 mg后24h子宮巨噬細(xì)胞顯著增加( P＝0.006)，6h后有增高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.123);補(bǔ)充20mg孕酮后6h子宮巨噬細(xì)胞顯著增加(P＝0.012)，24h后子宮巨噬細(xì)胞與陰性對(duì)照組無顯著差異(P＝0.129)。對(duì)子宮各層巨噬細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析，補(bǔ)充2mg孕酮后6h，子宮內(nèi)膜、肌膜、外膜巨噬細(xì)胞數(shù)與陰性組無顯著差異;24h后子宮內(nèi)膜及肌膜巨噬細(xì)胞顯著增加。補(bǔ)充20mg孕酮后6h，子宮肌膜巨噬細(xì)胞數(shù)顯著

10、增加( P＝0.000)，其余各層與陰性對(duì)照組無顯著差異;24h后子宮各層較陰性對(duì)照組均無顯著差異。
　　 (4)免疫組織化學(xué)顯示:子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮、血管內(nèi)皮、子宮肌層和外膜均可見M-CSF表達(dá)?？瞻讓?duì)照組及陰性對(duì)照組M-CSF表達(dá)量少，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。外源性補(bǔ)充100ng、1000ng雌激素后6h、24h，小鼠子宮M-CSF的表達(dá)較陰性對(duì)照組表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P分別為0.001、0.008）。外源性補(bǔ)充100ng雌激素

11、后24h子宮M-CSF表達(dá)較給藥后6h表達(dá)量顯著增加(P＝0.044)。1000ng雌激素組6h與24h子宮M-CSF表達(dá)無顯著差異。對(duì)子宮各層M-CSF表達(dá)量進(jìn)行分析，補(bǔ)充100ng、1000ng雌激素后6h及24h子宮內(nèi)膜、肌膜及外膜M-CSF表達(dá)較陰性對(duì)照組均顯著增高(P＝0.041);皮下注射100ng雌激素后6h、24h后子宮各層M-CSF表達(dá)與100ng雌激素組比較無顯著差異。
　　 (5)免疫組織化學(xué)顯示:外源性補(bǔ)

12、充孕激素2mg、20mg后6h子宮M-CSF表達(dá)較陰性對(duì)照組無顯著增高(P＝0.110);24h后兩個(gè)劑量組子宮M-CSF表達(dá)量均顯著增高(P＝0.001)。對(duì)子宮各層M-CSF表達(dá)量進(jìn)行分析，補(bǔ)充2mg孕酮后6h子宮內(nèi)膜M-CSF表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著增高(P＝0.041);24h后子宮各層M-CSF表達(dá)量較陰性對(duì)照組均顯著增高。補(bǔ)充20mg孕酮后6h子宮各層M-CSF表達(dá)均未見顯著增加，24h后子宮內(nèi)膜、肌膜、外膜M-CSF表達(dá)較陰性

13、對(duì)照組均顯著增加。皮下注射20mg后6h、24h后M-CSF表達(dá)與2mg組比較無顯著差異
　　 (6)生理劑量及超生理劑量雌激素或孕激素作用后，F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞的數(shù)量與M-CSF表達(dá)量在整個(gè)子宮的變化趨勢(shì)基本一致，但小鼠子宮內(nèi)F4/80巨噬細(xì)胞數(shù)量和M-CSF表達(dá)量均無顯著相關(guān)（雌激素組:γ＝0.498，P＝0.152;孕激素組:γ＝-0.051，P＝0.889）。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)生理及超生理劑