地塞米松影響肝細胞糖代謝的機制及吡格列酮的干預作用探討.pdf

1、背景與目的：
　　 糖皮質激素廣泛用于抗過敏和自身免疫性疾病及器官移植后免疫抑制等方面的治療,在取得顯著療效的同時也帶來了高血壓、糖尿病和骨質疏松等副作用。其中類固醇性糖尿病是最嚴重的副作用之一,在臨床上很常見,但其確切的發(fā)病機理尚不清楚。糖皮質激素可通過多種途徑降低外周組織對葡萄糖的攝取和利用,如促進肝臟中的糖原異生,抑制胰島素與其受體的結合,抑制葡萄糖轉運子-4向細胞膜的移位與錨著等。近年來的研究還表明糖皮質激素對胰島功能可

2、能還存在損傷作用。此外,葡萄糖刺激后的胰島素釋放,也可因大量糖皮質激素的存在而被抑制。但臨床上發(fā)現(xiàn)皮質醇增高時,胰島素分泌并未下降,提示更復雜的機理參與了類固醇性糖尿病的發(fā)生。
　　 過氧化物酶體增殖體激活受體(Peroxisome Proliferator ActivativedReceptors,PPARs)屬于Ⅱ型核受體超家族中的一員。噻唑烷二酮類化合物(Thiazolidinediones,TZDs):吡格咧酮(Piog

3、litazone)、羅格咧酮(Rosglitazone)等是PPARγ的合成型配體,通過與PPARγ結合,發(fā)揮增加肝臟和肌肉胰島素敏感性的作用,可用于類固醇性糖尿病的治療。Armando研究小組在動物實驗水平發(fā)現(xiàn)PPARs激動劑羅格咧酮和吡格咧酮的抗炎作用可被GR拮抗劑RU486阻斷,并于2005年通過細胞培養(yǎng)進一步發(fā)現(xiàn)TZDs可通過不依賴于PPARs的途徑激活糖皮質激素受體核轉位而起到抗炎的作用,Lemberger等的研究表明糖皮質激

4、素拮抗劑(RU486)可阻斷糖皮質激素對PPARα的基因表達的刺激作用,而PPARα在脂代謝中發(fā)揮重要作用。另有多項研究均可證明兩者在抗炎及促進脂肪細胞分化的作用途徑中存在交互影響。而PPARγ和GR同屬核受體家族,TZD的非PPARs依賴性對糖皮質激素的影響作用除了上述作用外,是否有拮抗糖皮質激素對糖代謝影響的作用呢?
　　 本研究采用地塞米松、吡格列酮與肝細胞株共同培養(yǎng),了解地塞米松在細胞水平對肝臟糖代謝和胰島素生物效應的影

5、響,并觀察吡格列酮在該過程中能否發(fā)揮拮抗作用,進一步明確地塞米松影響肝細胞糖代謝以及吡格列酮干預作用的分子機制,為臨床上預防和治療類固醇性糖尿病提供了理論依據。
　　 方法：
　　 1.HepG2細胞分為兩組,對照組和地塞米松組(1umol／L),并各設亞組,分別溫育24h,36h,48h,GOD—POD法測上清葡萄糖濃度,確定升高細胞葡萄糖濃度最明顯的地塞米松作用時間。
　　 2.將HepG2細胞分為五組(Ⅰ～

6、Ⅴ),分別為對照組(未加藥培養(yǎng)基),地米組(1umol／L),地米+胰島素組(胰島素終濃度為10-9mol.L-1),地米+吡格列酮組(吡格列酮終濃度10umol·L-1),地米+胰島素+吡格列酮組,先加地塞米松預先作用上述已確定的影響細胞葡萄糖濃度最明顯的地塞米松作用時間,各組再加入對應藥物共同溫育24h,觀察吡格列酮在該條件下對糖代謝糖原合成、糖異生及糖酵解各途徑的干預作用。各項觀察指標的測定:(糖原合成:糖原含量／蛋白含量(umo

7、l·mg-1),糖異生:葡萄糖生成量／蛋白含量(umol·mg-1),糖酵解:乳酸生成量／蛋白量(mmol·mg-1)和丙酮酸激酶活力／蛋白量(mU·mg-1))。
　　 3.將HepG2細胞分為四組:對照組,地塞米松組,RU486組,地塞米松+RU486組,上述四組細胞各設亞組,溫育時間分別為24h,48h,GOD—POD法測上清葡萄糖濃度以確定RU486阻斷GR的最佳時間。再將HepG2細胞分為六組:對照組,地米組,吡格列酮

8、組,RU486組,RU486+地米組,RU486+吡格列酮組,共同溫育上述已確定的RU486發(fā)揮作用的最佳時間,用GOD—POD法測各組細胞中葡萄糖濃度,觀察PPARγ和GR在肝細胞糖代謝之間是否存在交互作用。
　　 結果：
　　 1.地塞米松(濃度為1μmol／L)作用時間為48h時,較對照組細胞葡萄糖濃度升高最明顯(22.03±0.60 vs16.67±0.47,P0.05)。
　　 2.給予地塞米松作用后,

9、地塞米松組較對照組細胞葡萄糖濃度明顯升高(22.03±0.60 vs16.67±0.47,P<0.05),糖原含量明顯下降(6.31±0.48 vs12.27±0.81,P<0.05),糖異生量明顯增加(16.59±0.97 vs12.61±1.22,P<0.05),細胞乳酸生成量明顯下降(15.35±1.02 vs26.21±1.65,P<0.05),丙酮酸激酶活力有所下降,但差異無統(tǒng)計學意義(102.6±12.47 vs156.1±

10、17.43,P>0.05)。給予吡格列酮作用后:①葡萄糖消耗:地塞米松+吡格列酮組較地塞米松組細胞葡萄糖濃度有所下降(18.58±0.20 vs22.03±0.60,P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰島素組較地塞米松+胰島素組和地塞米松+吡格列酮組細胞葡萄糖濃度均可進一步下降,但差異無明顯統(tǒng)計學意義(17.91±0.25 vs18.03±0.36,17.91±0.25 vs18.58±0.20,P>0.05)。②糖原合成:地塞米松+

11、吡格列酮組較地塞米松組細胞糖原合成增加(15.06±0.79 vs6.31±0.48,P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰島素組較地塞米松+吡格列酮組細胞糖原合成進一步增加(20.01±0.73 vs15.06±0.79,P<0.05),但較地塞米松+胰島素組糖原合成量差異無統(tǒng)計學意義(20.01±0.73 vs19.15±0.94,P>0.05)。③糖異生量:地塞米松+吡格列酮組較地塞米松組細胞糖異生量明顯下降(4.88±0.47

12、vs16.59±0.97,P<0.05),地塞米松+吡格列酮+胰島素組較地塞米松+胰島素組細胞糖異生量進一步下降(3.21±0.42 vs10.22±0.91,P<0.05),但較地塞米松+吡格列酮組差異無統(tǒng)計學意義(3.21±0.42 vs4.88±0.47,P>0.05)④糖酵解:地塞米松+吡格列酮組較地塞米松組細胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力較地塞米松組有所增加,但差異無統(tǒng)計學意義(乳酸生成量:19.43±1.16 vs15.35±

13、1.02,P>0.05:丙酮酸激酶活力:133.2±15.06 vs102.6±12.47,P>0.05),地塞米松+吡格列酮+胰島素組較地塞米松組和地塞米松+吡格列酮組細胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力均明顯升高(乳酸生成量:39.53±2.32 vs15.35±1.02,39.53±2.32 vs19.43±1.16,P<0.05；丙酮酸激酶活力:232.5±25.17 vs102.6±12.47,232.5±25.17 vs133.2

14、±15.06,P<0.05),但較地塞米松+胰島素組乳酸生成量增加(39.53±2.32vs30.63±1.75,P<0.05),丙酮酸激酶活力差異無統(tǒng)計學意義(232.5±25.17 vs212.4±18.47,P>0.05)。
　　 3.RU486(10 umol·L-1)作用時間為24h時,各組細胞葡萄糖濃度差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。作用時間為48h時,對照組、RU486組和RU486+地米組三組細胞上清葡萄糖濃度

15、無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但較地塞米松組葡萄糖濃度均明顯降低,差別有統(tǒng)計學意義(16.67±0.47 vs22.03±0.60,15.54±0.35 vs22.03±0.60,17.69±0.33 vs22.03±0.60,P<0.05),由此確定RU486在該濃度下阻斷了地塞米松的升糖作用時間為48h。在此基礎上,RU486+吡格列酮組較吡格列酮組細胞上清葡萄糖濃度升高,差異有統(tǒng)計學意義(分別為:18.50±0.82 vs14.2

16、3±0.92,P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.地塞米松作用于肝細胞使其葡萄糖攝取能力下降。
　　 2.毗格列酮在地塞米松作用的肝細胞糖代謝中主要通過促進糖原合成和抑制糖異生發(fā)揮干預作用,并具有胰島素增敏劑的作用。
　　 3.PPARγ和GR在肝細胞糖代謝方面可能存在相互作用:地塞米松可能沒有通過GR以外的PPARγ途徑發(fā)揮作用。吡格列酮可能通過PPARγ以外的GR發(fā)揮了部分降糖的作用,當GR被阻