高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞Gremlin表達(dá)的變化及吡格列酮對(duì)其干預(yù)的研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetesmellitus，DM)常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因，因此探索DN的發(fā)病機(jī)制和防治策略是廣大腎臟病學(xué)者熱切關(guān)注的課題。gremlin是半胱氨酸結(jié)超家族的成員之一，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2/4/7內(nèi)源性拮抗劑，近年研究顯示gremlin與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能有密切關(guān)系，值得進(jìn)一步研究探討，為糖尿病腎病的防治尋找新的干預(yù)途

2、徑。
　　 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性糖尿病腎病患者腎活檢標(biāo)本gremlin mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，尤其是小管間質(zhì)纖維化區(qū)域，并同轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)分布相同。1型糖尿病STZ小鼠模型敲除grem1基因(grem1+/-)能抑制糖尿病腎病進(jìn)展。抑制gremlin表達(dá)和維持BMP-7活性對(duì)糖尿病腎病具有保護(hù)作用。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明gremlin參與了糖尿病腎病發(fā)病。我們課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)體外高糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞胞外

3、調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase ERK1/2)通路被激活。ERK通路調(diào)控許多轉(zhuǎn)錄因子，控制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞外基質(zhì)聚集。高糖培養(yǎng)下的牛視網(wǎng)膜外膜細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)和STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型的視網(wǎng)膜體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明高糖環(huán)境下激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase MAPK)，并且MAPK可影響gremlin基因表達(dá)。因而，

4、ERK激活可能是高糖導(dǎo)致腎小球損傷的重要因素。有研究證實(shí)，吡格列酮可通過(guò)PPAR-γ通路抑制小鼠腎小球系膜細(xì)胞AP-1和TGF-β1及其下游fibronectin合成，還可抑制高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞DAG-PKC-ERK旁路的激活可能在延緩DN發(fā)生發(fā)展方面有一定的干預(yù)作用。
　　 目前有關(guān)gremlin在糖尿病腎病中的作用研究尚少。我們課題組前期研究已證實(shí)，gremlin可促進(jìn)體外高糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extrac

5、ellular matrix EMC)合成聚集，然而，gremlin和TGF-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor CTGF)之間具體復(fù)雜的相互作用機(jī)制，gremlin是否通過(guò)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路參與糖尿病腎病發(fā)病以及吡格列酮對(duì)gremlin是否有干預(yù)作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，采用基因轉(zhuǎn)染(gene transfection)，RNA干擾(RNA int

6、erference)和吡格列酮藥物干預(yù)方法，分子生物學(xué)檢測(cè)手段，對(duì)體外高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞gremlin基因的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，觀察高糖環(huán)境中g(shù)remlin過(guò)表達(dá)和抑制狀態(tài)下腎小球系膜細(xì)胞中g(shù)remlin、pErk1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型膠原表達(dá)的變化及高糖環(huán)境下gremlin基因在EMC代謝中的作用，為進(jìn)一步揭示糖尿病腎病發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制及尋找早期防治方法提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、G

7、remlin基因轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響。
　　 1)小鼠系膜細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；
　　 小鼠腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)條件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml),Streptomycin(100ug/ml),37℃,5％CO2-95％air。六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)2x106，或不加抗生素，培養(yǎng)24小時(shí)。用Lipofectanine2000 reagent(

8、Invitrogen)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒。脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，細(xì)胞進(jìn)一步在DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(HG;30 mM)或正常糖培養(yǎng)基(NG;5.5 mM)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。提取六孔板培養(yǎng)細(xì)胞蛋白及RNA。
　　 2)小鼠系膜細(xì)胞分組及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)；
　　 小鼠腎小球系膜細(xì)胞分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，

9、即正常對(duì)照組(NG組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，D-葡萄糖5.5mmol/l)、高糖組(HG組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+空質(zhì)粒組(HG+Ⅴ組，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(HG+P組，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分組情況給予高糖刺激，以開(kāi)始給予高糖刺激定為“0”時(shí)，計(jì)算各組刺激時(shí)間。于24 h末收集細(xì)胞

10、，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)，Westernblot檢測(cè)gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)gremlin mRNA的表達(dá)，及放射免疫法(RIA)測(cè)定各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 2、Gremlin shRNA基因轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響。
　　 1)小鼠系膜細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；
　　 小鼠

11、腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)條件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml), Streptomycin(100ug/ml),37C,5％CO2-95％air。六孔板，每孔細(xì)胞數(shù)2x106，或不加抗生素，培養(yǎng)24小時(shí)。用Lipofectanine2000 reagent(Invitrogen)轉(zhuǎn)染pGenesil1.1和pGenesil1.1-shGrem1質(zhì)粒。脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照Lipo

12、feetamineTM2000說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，細(xì)胞進(jìn)一步在DMEM/F12高糖培養(yǎng)基(HG;30mM)或正常糖培養(yǎng)基(NG;5.5 mM)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。提取六孔板培養(yǎng)細(xì)胞蛋白及RNA。
　　 2)小鼠系膜細(xì)胞分組及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)；
　　 小鼠腎小球系膜細(xì)胞分成4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即正常對(duì)照組（NG組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，D-葡萄糖5.5mmol/l）、高糖組(HG組，非轉(zhuǎn)染的系膜細(xì)胞，D-葡萄糖30m

13、mol/l)、高糖+空質(zhì)粒組（HG+Ⅴ組，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pGenesil1.1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l）、高糖+shRNA基因轉(zhuǎn)染組(HG+SH組，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染pGenesil1.1-shGrem1質(zhì)粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分組情況給予高糖刺激，以開(kāi)始給予高糖刺激定為“0”時(shí)，計(jì)算各組刺激時(shí)間。于24 h末收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè)gremlin、pErk1/

14、2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)gremlin mRNA的表達(dá)，及放射免疫法(RIA)測(cè)定各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 3、吡格列酮對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞gremlin表達(dá)的影響。
　　 將小鼠腎小球系膜細(xì)胞分為4組:正常對(duì)照組(A組，D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖組（B組，D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+吡格列酮組(C組，吡格列酮:10μmol

15、/L)、高糖+PD98059組(D組，PD98059∶20μmol/L)，刺激24小時(shí)后，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PCNA蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè)gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)gremlin mRNA的表達(dá)，及放射免疫法(RIA)測(cè)定各組細(xì)胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結(jié)果用總蛋白校正）。
　　 結(jié)果:
　　 1、Gremlin基因轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境中系

16、膜細(xì)胞胞外調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響。
　　 ①免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:正常對(duì)照組PCNA蛋白在小鼠系膜細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有基礎(chǔ)量的表達(dá)，高糖刺激后，表達(dá)信號(hào)呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例也明顯的增加，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較高糖組表達(dá)進(jìn)一步增高，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Greml質(zhì)粒進(jìn)一步促進(jìn)高糖刺激導(dǎo)致的小鼠系膜細(xì)胞的增殖;②Western blot結(jié)果:高糖刺激組greml

17、in、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達(dá)較正常對(duì)照組增高，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組這四者表達(dá)較高糖組進(jìn)一步升高;③RT-PCR結(jié)果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達(dá)較正常對(duì)照組增高，趨勢(shì)與Western blot結(jié)果大致相同，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組gremlin mRNA表達(dá)較高糖組

18、進(jìn)一步升高;④放射免疫結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度升高(P＜0.01);與高糖組相比，高糖+pEGFP-N1質(zhì)粒組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）;高糖+pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組升高(P＜0.01)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-Grem1質(zhì)粒進(jìn)一步促進(jìn)高糖刺激導(dǎo)致的Ⅳ型膠原聚集。
　　 2、Gremlin shRNA基因轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境中系膜細(xì)胞胞外調(diào)節(jié)

19、激酶表達(dá)的影響。
　　 ①免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:正常對(duì)照組PCNA蛋白在小鼠系膜細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有基礎(chǔ)量的表達(dá)，高糖刺激后，表達(dá)信號(hào)呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例也明顯的增加，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較高糖組表達(dá)明顯降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒抑制了高糖刺激導(dǎo)致的小鼠系膜細(xì)胞增殖;②Western blot結(jié)果:高糖刺激組greml

20、in、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達(dá)較正常對(duì)照組增高，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較高糖組表達(dá)明顯降低;③RT-PCR結(jié)果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達(dá)較正常對(duì)照組增高，趨勢(shì)與Western blot結(jié)果大致相同，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組較高糖組無(wú)明顯變化，高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組較高糖組表達(dá)明顯

21、降低。④放射免疫結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度升高（P＜0.01）;與高糖組相比，高糖+pGenesil1.1質(zhì)粒組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）;高糖+pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組降低(P＜0.01)，說(shuō)明pGenesil1.1-shGrem質(zhì)粒轉(zhuǎn)染促進(jìn)了Ⅳ型膠原降解。
　　 3、吡格列酮對(duì)高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞gremlin表達(dá)的影響。
　

22、　 ①免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:正常對(duì)照組PCNA蛋白在小鼠系膜細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有基礎(chǔ)量的表達(dá)，高糖刺激后，表達(dá)信號(hào)呈強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例也明顯的增加，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖組表達(dá)明顯降低，說(shuō)明吡格列酮及PD98059抑制了高糖刺激所致的小鼠系膜細(xì)胞增殖;②Western blot結(jié)果:高糖刺激組gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表達(dá)較正常對(duì)照組增高，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖

23、組表達(dá)明顯降低;③RT-PCR結(jié)果:高糖刺激組gremlin mRNA水平表達(dá)較正常對(duì)照組增高，趨勢(shì)與Western blot結(jié)果大致相同，高糖+吡格列酮組及高糖+PD98059組較高糖組表達(dá)明顯降低;④放射免疫結(jié)果顯示:高糖組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較正常對(duì)照組升高(P＜0.01)，高糖+吡格列酮組(10μmol/L)和高糖+PD98059組（20μmol/L）組MMC上清液中Ⅳ型膠原濃度較高糖組降低（P＜0.01），說(shuō)明吡格列酮及

24、PD98059促進(jìn)了Ⅳ型膠原的降解。
　　 結(jié)論:
　　 1、轉(zhuǎn)染gremlin基因可促進(jìn)高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞gremlin表達(dá)，促進(jìn)gremlin表達(dá)后又可增加pERK1/2、TGF-β1、CTGF和Ⅳ型膠原表達(dá)，提示gremlin基因可能通過(guò)激活高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)ERK1/2通路促進(jìn)TGF-β1、CTGF表達(dá)及Ⅳ型膠原聚集，提示gremlin基因可能參與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展。
　　 2、轉(zhuǎn)染gr

25、emlin shRNA基因可抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞gremlin表達(dá)，抑制gremlin表達(dá)后又可下調(diào)pERK1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型膠原表達(dá)，提示gremlin shRNA基因可能通過(guò)抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞ERK1/2通路激活阻礙TGF-β1、CTGF表達(dá)及Ⅳ型膠原聚集，提示gremlin shRNA基因可能對(duì)糖尿病腎病有保護(hù)作用。
　　 3、吡格列酮可抑制高糖環(huán)境下小鼠腎小球系膜細(xì)胞中g(shù)rem