單純胰島素抵抗及糖尿病大鼠肝脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)變化.pdf

1、目的：胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是導(dǎo)致2型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的危險(xiǎn)因素，是2型糖尿病的基本特征。胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下，血中游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）增加，肝臟中的游離脂肪酸和甘油三酯也增加。肝臟的脂肪酸有以下代謝途徑：一是進(jìn)入線粒體進(jìn)行β-氧化。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（camitine palmitoyltransferaseⅠ，CPTⅠ）是線粒體氧化長鏈脂肪酸的關(guān)鍵酶。

2、二是進(jìn)入過氧化物酶體進(jìn)行β-氧化。軟脂酸輔酶A氧化酶（palmitoyl-CoA oxidase，ACOX1）主要參與直鏈極長鏈脂肪酸氧化；降植烷酰輔酶A氧化酶（pristanoyl-CoA oxidase，ACOX3）主要參與支鏈脂肪酸的氧化。酯酰輔酶A氧化酶2（acyl-CoA oxidase2，ACOX2）催化三羥及二羥膽甾烷?；o酶A側(cè)鏈的氧化脫氫，參與膽汁酸的合成。三是再酯化合成甘油三酯。二?；视王；D(zhuǎn)移酶（diacylgl

3、ycerol transferase，DGATs）催化甘油三酯合成體系中最后一步，是甘油三酯合成的關(guān)鍵酶，它有兩個(gè)亞型：DGAT1和DGAT2。上述途徑共同維持肝脂肪酸代謝的動(dòng)態(tài)平衡。
　　 糖尿病狀態(tài)下，由于胰島素作用缺陷引起葡萄糖利用障礙，使組織更多地依賴脂質(zhì)氧化供給能量。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病和單純胰島素抵抗大鼠肝不僅線粒體脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)，而且過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)。在大劑量STZ所致糖尿病大鼠，過氧化物酶體

4、脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)與ACOX1的mRNA表達(dá)增加有關(guān)。那么在2型糖尿病和單純胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β-氧化活性的增強(qiáng)與β-氧化途徑中哪些酶基因表達(dá)增加有關(guān)呢?
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα），是核受體轉(zhuǎn)錄因子，被配體激活后，通過調(diào)控線粒體和過氧化物酶體β-氧化途徑中的CPIⅠ、ACOX1、LBP等下游基因的轉(zhuǎn)錄，增加脂肪酸的分解代謝。研究發(fā)現(xiàn)，大劑量STZ所致糖尿病大鼠肝組織PPARα

5、表達(dá)是增加的，那么2型糖尿病和單純胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下PPARα表達(dá)如何呢?
　　 胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下肝臟常伴有甘油三酯沉積，我室以前的研究也在胰島素抵抗和2型糖尿病大鼠肝中發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象。肝甘油三酯沉積是否與DGAT酶基因表達(dá)增加有關(guān)?
　　 基于上述目的，本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為對(duì)象，采用高脂飲食復(fù)制胰島素抵抗模型，再復(fù)加腹腔注射小劑量STZ，復(fù)制2型糖尿病模型。在此基礎(chǔ)上，觀察肝組織脂肪酸代謝調(diào)節(jié)因子PPARα基因，

6、線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化相關(guān)酶CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx基因，以及甘油三酯合成限速酶DGAT1和DGAT2基因的表達(dá)情況，從而探討胰島素抵抗和2型糖尿病狀態(tài)下肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本處理
　　 根據(jù)本試驗(yàn)室王曉凌等的造模方法，以成年雄性SD大鼠（體重220-240g）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用高脂飲食（脂類以

7、豬油為主，熱量比占59.8％）復(fù)制胰島素抵抗模型（insulin resistance group，IR）；在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，一次性注射小劑量STZ復(fù)制2型糖尿病大鼠模型（diabetic mellitus group，DM）。血清，用于血糖、血總游離脂肪酸測(cè)定；肝臟組織，用于肝組織油紅染色，肝總游離脂肪酸，甘油三酯含量測(cè)定，及總RNA提取。
　　 2血糖測(cè)定
　　 用HITACHI7170A型全自動(dòng)生化分析儀，氧化

8、酶法測(cè)定血糖。以mmol/L表示。
　　 3血清及肝組織總游離脂肪酸的測(cè)定
　　 用南京建成總脂肪酸測(cè)定試劑盒，銅顯色法測(cè)定血清和肝組織總游離脂肪酸的含量。分別用mmol/L和μmol/gprot表示。
　　 4肝組織甘油三酯含量的測(cè)定
　　 用氧化酶法測(cè)定肝甘油三酯含量，結(jié)果用每克肝組織所含甘油三酯微摩爾數(shù)表示（μmol/g組織）。
　　 5肝組織有關(guān)基因mRNA表達(dá)的測(cè)定
　　 用Pr

9、omega總RNA提取試劑盒提取肝組織總RNA。用NanoDrop ND-1000紫外/可見光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量。以18S rRNA做內(nèi)參，real-time PCR測(cè)定PPARα、CPTⅠ、ACOX1、ACOX2、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB、SCPx、DGAT1和DGAT2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 6數(shù)據(jù)處理
　　 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)所測(cè)定結(jié)果

10、進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，做兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（雙尾），檢驗(yàn)以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1造模
　　 1.1 OGTT試驗(yàn)驗(yàn)證胰島素抵抗
　　 我室王曉凌等已經(jīng)通過OGTT、ISI和血糖鉗試驗(yàn)證實(shí)，此種造模方法，大鼠于高脂喂養(yǎng)8周時(shí)產(chǎn)生明顯胰島素抵抗，因此，在我們的試驗(yàn)中，只用OGTT試驗(yàn)驗(yàn)證胰島素抵抗的產(chǎn)生。
　　 高脂喂養(yǎng)組的糖耐量曲線下面積（AUC）平均值為31.

11、138±1.797mmol/L*h，高于對(duì)照組27.822±1.271mmol/L*h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。（AUC=0.5×空腹血糖+30 min血糖+1.5×60 min血糖+120 min血糖）表明，胰島素抵抗模型成立。
　　 2空腹血糖變化
　　 空腹血糖對(duì)照組為4.966±0.433mmol/L，單純胰島素抵抗組為5.511±0.345mmol/L，糖尿病組為12.717±1.862mmol/L。

12、單純胰島素抵抗組與對(duì)照組相比空腹血糖增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；糖尿病組和對(duì)照組相比，空腹血糖增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明，糖尿病模型成立。
　　 3血清總游離脂肪酸的變化
　　 對(duì)照組為0.581±0.114mmol/L，單純胰島素抵抗組為1.602±0.112mmol/L，糖尿病組為1.558±0.084mmol/L。與對(duì)照組相比，單純胰島素抵抗組和糖尿病組血清總游離脂肪酸均增加，差異有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明，單純胰島素抵抗和糖尿病狀態(tài)下，機(jī)體脂代謝異常。
　　 4肝組織總游離脂肪酸的變化
　　 對(duì)照組為81.365±10.609μmol/gprot，單純胰島素抵抗組為213.922±40.809μmol/gprot，糖尿病組為156.080±19.268μmol/gprot。與對(duì)照組相比，單純胰島素抵抗組和糖尿病組肝組織總游離脂肪酸均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 5肝

14、組織油紅染色
　　 油紅染色顯示，Con組僅發(fā)現(xiàn)極少量脂滴存在；HF組和DM組出現(xiàn)大量彌漫性脂肪滴，表明胰島素抵抗和糖尿病組大鼠肝組織脂肪沉積。
　　 6肝組織甘油三酯含量的變化
　　 對(duì)照組肝組織脂肪含量為11.30±1.89μmol/g組織，單純胰島素抵抗組為34.94±4.93μmol/g組織，糖尿病組為51.47±7.77μmol/g組織。與對(duì)照組相比，單純胰島素抵抗組和糖尿病組肝組織甘油三酯含量均增加，

15、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 結(jié)果4-6表明，單純胰島素抵抗和糖尿病狀態(tài)下，肝組織脂代謝異常。
　　 7待測(cè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化
　　 對(duì)照組為0.099±0.018，單純胰島素抵抗組為0.072±0.015，糖尿病組為0.098±0.016。ACOX2相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照組相比，單純胰島素抵抗組表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），糖尿病組變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。表明胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)

16、下很可能膽汁酸的合成是降低的。
　　 結(jié)論：
　　 1胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，肝過氧化物酶體脂肪酸β-氧化的增加與ACOX1、LBP、THLA/B、ACOX3、DBP、SCPx基因的表達(dá)增加有關(guān)；肝線粒體脂肪酸β-氧化的增加與CPTⅠ基因的表達(dá)無關(guān)。
　　 2糖尿病狀態(tài)下，肝過氧化物酶體脂肪酸β-氧化增加與ACOX1、LBP、DBP、THLA/B基因表達(dá)增加有關(guān)；肝線粒體脂肪酸β-氧化增加與CPTⅠ基因的表達(dá)無關(guān)。