重組人E1A激活基因阻遏子-myc-His融合糖蛋白的表達(dá)純化及功能鑒定.pdf

1、目的：E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）是1998年Gill博士利用酵母雙雜交技術(shù)克隆的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)因子。CREG基因可與外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子區(qū)，從而阻遏E1A蛋白和E2F對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而E1A、E2F均具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，所以CREG可能通過(guò)與E1A、E2F競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用而起到

2、促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，去血清能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)從合成表型逆轉(zhuǎn)為分化表型，同時(shí)CREG蛋白表達(dá)明顯增加。大鼠頸動(dòng)脈拉傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CREG基因表達(dá)與VSMCs增殖能力呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)其可能參與了VSMCs表型調(diào)控。Veal博士等證實(shí)CREG是一種分泌型糖蛋白，可以與胰島素樣生長(zhǎng)因子II競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜胰島素樣生長(zhǎng)因子受體I

3、I，以自分泌和旁分泌兩種途徑對(duì)細(xì)胞功能進(jìn)行調(diào)控。為進(jìn)一步明確CREG糖蛋白的功能,本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白印跡（Westernblot）及Ni-NTA親和層析等方法表達(dá)、純化重組hCREG糖蛋白，并用流式細(xì)胞周期分析、5-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）摻入實(shí)驗(yàn)等方法驗(yàn)證重組人CREG（hCREG）糖蛋白具備抑制體外培養(yǎng)的人胸廓內(nèi)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human internal thoracic artery-Sheny

4、ang,HITASY)增殖的生物學(xué)功能，為hCREG蛋白的工程化生產(chǎn)提供前期研究基礎(chǔ)。
　　方法：1、用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增終止密碼突變的hCREG開放讀碼框并構(gòu)建pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表達(dá)載體。2、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染人293F細(xì)胞株并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆，Westernblot方法鑒定hCREG/myc-His融合蛋白的表達(dá)，糖苷酶法及Westernblotting行hCREG/myc

5、-His融合蛋白的糖基化分析。3、根據(jù)6×His親和層析原理，應(yīng)用Ni-NTA柱純化重組hCREG蛋白，純化后蛋白通過(guò)HiTrap脫鹽柱脫鹽。4、用流式細(xì)胞周期分析研究添加0.5μg/mL、1μg/mL及2μg/mL重組hCREG/myc-His融合糖蛋白對(duì)體外培養(yǎng)HITASY細(xì)胞增殖的影響。用BrdU摻入方法研究添加重組蛋白對(duì)體外培養(yǎng)HITASY細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增含終止密碼突變的hCREGcDNA片段，

6、經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切構(gòu)建了pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表達(dá)載體，酶切及測(cè)序結(jié)果均證實(shí)構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。
　　穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1myc-His/hCREG的293F細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞裂解產(chǎn)物，分別以Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His行Westernblot檢測(cè)。hCREG抗體可檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組多兩條約30KD的融合蛋白表達(dá)條帶，myc抗體及His抗體均檢測(cè)到大小約為3

7、0KD的融合蛋白表達(dá)。將穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1myc-His/hCREG的293F細(xì)胞裂解產(chǎn)物及經(jīng)PNGaseF處理過(guò)的樣品分別行Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的Westernblot檢測(cè)。結(jié)果顯示經(jīng)PNGaseF處理后，hCREG融合蛋白分子量由30KD降低至25KD，電泳條帶下移，證明帶有myc和His標(biāo)簽的重組hCREG蛋白為糖基化蛋白。
　　根據(jù)6×His與Ni親合層析的原理用Ni-NTA純化h

8、CREG重組蛋白。收集的洗脫液經(jīng)Centriprep離心超濾管（10000NMWL）濃縮后，經(jīng)BCA法測(cè)定并與蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，重組hCREG蛋白濃度為1.6mg/mL?？捡R斯亮蘭染色可見30KD大小的較單一條帶，經(jīng)image-J軟件分析，純度為92％。濃縮并脫鹽后的純化蛋白經(jīng)PNGaseF處理后分子量由30KD降至25KD，條帶下移，證實(shí)純化后的蛋白仍保留了糖基化形式。
　　流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析結(jié)果提示重組hCREG蛋白與對(duì)照

9、組相比可抑制體外培養(yǎng)的HITASY細(xì)胞增殖，G0/G1期細(xì)胞比率（共計(jì)數(shù)2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞）顯著增加，且低濃度組的抑制效應(yīng)要高于高濃度組。BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，添加2μg/mL重組hCREG蛋白組與對(duì)照組相比可顯著抑制體外培養(yǎng)的HITASY細(xì)胞增殖，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的比率降低。組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：pcDNA3.1myc-His/hCREG真核表達(dá)載體的構(gòu)建及具有生物學(xué)功能的重組hCREG/myc-His糖