長效重組人Bikunin的表達及鑒定.pdf

1、Bikunin是一種含硫酸軟骨素糖鏈的血漿糖蛋白,在肝臟中合成,由腎臟代謝后隨尿液排出。研究發(fā)現(xiàn),Bikunin可顯著抑制胰蛋白酶,纖溶酶,糜蛋白酶和組織蛋白酶等多種蛋白酶的活性,并能抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生,在急性胰腺炎,急性循環(huán)衰竭等疾病的治療中有著廣泛的應(yīng)用。目前市售的Bikunin制劑(烏司他丁)是從人尿中提純獲得,其半衰期較短,且受尿液來源限制,并存在安全隱患及純化困難等問題,限制了其臨床應(yīng)用。因此,探尋獲取高胰酶抑制活性、長半

2、衰期Bikunin的制備方法已成為當(dāng)前Bikunin的研究熱點。
　　Nanobody是克隆駱駝血清中重鏈抗體可變區(qū)而獲得的特殊抗體,它保留了原始抗體的抗原表位高結(jié)合能力。研究證明,將抗人血清白蛋白nanobody(aAlb)與其他藥物偶聯(lián)或融合使用,可以顯著延長該藥物在血液中的半衰期,進而成為解決Bikunin半衰期問題的有效方法之一。
　　本課題中,我們利用基因工程手段在CHO細胞中表達了一種全新的aAlb-Bikuni

3、n融合蛋白,并最終通過Ni2+金屬螯和層析純化獲得目的蛋白。蛋白印跡分析表明目的蛋白分子量約為40 kD,并能特異性結(jié)合人血清白蛋白及抗Bikunin抗體。通過表面共振技術(shù)測得目的蛋白與人和小鼠血清白蛋白親和力分別為3.93×10-8 M和4.86×10-8 M。體外胰酶抑制試驗測得此融合蛋白比活性高達5800 IU/mg,且其在動物體內(nèi)半衰期長達6h。此研究首次應(yīng)用抗人血清白蛋白Nanobody與Bikunin融合表達,獲得了活性高且