乙腦病毒E蛋白基因的克隆、表達及純化.pdf

1、目的：利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建乙腦病毒（JEV）E蛋白基因重組載體，并在原核細(xì)胞BL21（DE3）中表達。根據(jù)影響其表達情況的各因素的改變，摸索最佳誘導(dǎo)表達條件；通過Western blotting法檢測所表達蛋白的抗原活性；Ni2+-NTA樹脂親和純化目的蛋白，為進一步制備實驗室診斷抗原打下基礎(chǔ)。 方法：①SDS堿裂解法提取重組質(zhì)粒JEV-E，分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ/HindⅢ，SacⅠ酶切鑒定，并送測序公司測序鑒定以

2、確定是否正確克隆。②加入適當(dāng)濃度的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，在單因素考察的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交實驗L9（34），針對誘導(dǎo)過程中對菌體蛋白表達有影響的4個因素：誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度，分別取3個水平進行考察。③利用Western blotting法檢測誘導(dǎo)表達的蛋白，SDS-PAGE電泳后將膠上蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉作為封閉液封閉過夜，一抗為鼠源性單抗和兔源性多抗，二抗為山羊抗小鼠HRP標(biāo)記抗體和山羊抗兔HRP

3、標(biāo)記抗體，最后用化學(xué)發(fā)光檢測。④Nj2+-NTA樹脂純化重組E蛋白，用8 mmol/L的尿素溶解包涵體，pH7．8的PB和尿素平衡樹脂后將樣品上柱，分別用20、50、100、200 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。 結(jié)果：①提取出來的質(zhì)粒經(jīng)過多步酶切鑒定和序列測定，可以證明目的蛋白基因成功克隆到原核表達載體pET32a（+）中。②通過正交實驗的設(shè)計，實驗證實A282C2D2為最佳搭配組合，即在30℃、OD6000．5、IPTG0

4、．25 mmol/L、誘導(dǎo)時間5h條件下進行誘導(dǎo)的目的蛋白產(chǎn)量最高，因此可以作為擴大培養(yǎng)的最佳條件。③成功地在大腸桿菌中表達了JEV-E蛋白，Western blotting反應(yīng)證實所表達的E蛋白可以被JEV單抗和多抗所識別。④收集各個濃度咪唑沈脫的樣品，SDS-PAGE分析可見，在咪唑濃度為100 mmol/L時，目的蛋白從Ni2+柱上洗脫下來。 結(jié)論：①JEV-E蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在，正確處理包涵體，可以得

5、到較高含量的E蛋白；②JEV-E蛋白在原核細(xì)胞系統(tǒng)進行表達，所以不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達量差異性較大。通過比較四因素的R值可得各因素對指標(biāo)影響次序為誘導(dǎo)劑量（C）>誘導(dǎo)時機（A）>誘導(dǎo)溫度（B）>誘導(dǎo)時間（D）。③表達的E蛋白經(jīng)SDS-PAGE，Western-blotting分析得到證實且有抗原活性，有可能作為檢測JEV抗體的診斷抗原。④重組E蛋白可以通過Nj2+-NTA樹脂得以純化，為抗JEV抗體的制備和基因工程疫苗等方面的進一