乙腦病毒E蛋白基因的克隆、表達(dá)及純化.pdf

1、目的：利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建乙腦病毒（JEV）E蛋白基因重組載體，并在原核細(xì)胞BL21（DE3）中表達(dá)。根據(jù)影響其表達(dá)情況的各因素的改變，摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件；通過Western blotting法檢測(cè)所表達(dá)蛋白的抗原活性；Ni2+-NTA樹脂親和純化目的蛋白，為進(jìn)一步制備實(shí)驗(yàn)室診斷抗原打下基礎(chǔ)。 方法：①SDS堿裂解法提取重組質(zhì)粒JEV-E，分別經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ/HindⅢ，SacⅠ酶切鑒定，并送測(cè)序公司測(cè)序鑒定以

2、確定是否正確克隆。②加入適當(dāng)濃度的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9（34），針對(duì)誘導(dǎo)過程中對(duì)菌體蛋白表達(dá)有影響的4個(gè)因素：誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度，分別取3個(gè)水平進(jìn)行考察。③利用Western blotting法檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，SDS-PAGE電泳后將膠上蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉作為封閉液封閉過夜，一抗為鼠源性單抗和兔源性多抗，二抗為山羊抗小鼠HRP標(biāo)記抗體和山羊抗兔HRP

3、標(biāo)記抗體，最后用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。④Nj2+-NTA樹脂純化重組E蛋白，用8 mmol/L的尿素溶解包涵體，pH7．8的PB和尿素平衡樹脂后將樣品上柱，分別用20、50、100、200 mmol/L的咪唑洗脫目的蛋白。 結(jié)果：①提取出來的質(zhì)粒經(jīng)過多步酶切鑒定和序列測(cè)定，可以證明目的蛋白基因成功克隆到原核表達(dá)載體pET32a（+）中。②通過正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)A282C2D2為最佳搭配組合，即在30℃、OD6000．5、IPTG0

4、．25 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間5h條件下進(jìn)行誘導(dǎo)的目的蛋白產(chǎn)量最高，因此可以作為擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳條件。③成功地在大腸桿菌中表達(dá)了JEV-E蛋白，Western blotting反應(yīng)證實(shí)所表達(dá)的E蛋白可以被JEV單抗和多抗所識(shí)別。④收集各個(gè)濃度咪唑沈脫的樣品，SDS-PAGE分析可見，在咪唑濃度為100 mmol/L時(shí)，目的蛋白從Ni2+柱上洗脫下來。 結(jié)論：①JEV-E蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在，正確處理包涵體，可以得

5、到較高含量的E蛋白；②JEV-E蛋白在原核細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，所以不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)量差異性較大。通過比較四因素的R值可得各因素對(duì)指標(biāo)影響次序?yàn)檎T導(dǎo)劑量（C）>誘導(dǎo)時(shí)機(jī)（A）>誘導(dǎo)溫度（B）>誘導(dǎo)時(shí)間（D）。③表達(dá)的E蛋白經(jīng)SDS-PAGE，Western-blotting分析得到證實(shí)且有抗原活性，有可能作為檢測(cè)JEV抗體的診斷抗原。④重組E蛋白可以通過Nj2+-NTA樹脂得以純化，為抗JEV抗體的制備和基因工程疫苗等方面的進(jìn)一