E1A激活基因阻遏子在小鼠胚胎發(fā)育中的表達.pdf

1、目的: E1A激活基因阻遏子(CREG) 是從HeLa細胞cDNA文庫中克隆的一種新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關因子。它可直接與腺病毒E1A 蛋白和轉(zhuǎn)錄因子E2F競爭結(jié)合靶基因的啟動子區(qū),阻遏它們對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而抑制細胞的增殖，促進細胞分化。CREG蛋白與6-磷酸甘露醇胰島素樣生長因子II受體相關，在多種腫瘤細胞中發(fā)揮抑制增殖和促進分化的作用。先前本研究室應用差異顯示PCR技術在體外培養(yǎng)的分化表型人VSMCs克隆株HITASY細胞中篩選到高表

2、達差異性CREG基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)CREG基因表達與HITASY細胞的分化狀態(tài)密切相關，即去血清培養(yǎng)誘導HITASY細胞由合成表型逆轉(zhuǎn)為分化表型的過程中伴有CREG mRNA和蛋白表達上調(diào)。CREG可以與血清反應因子協(xié)同作用于平滑肌α-肌動蛋白(SM α-actin) 啟動子區(qū)的CArG元件從而啟動SM α-actin的表達，參與體外培養(yǎng)的大鼠原代VSMCs表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控。大鼠頸動脈拉傷實驗證實，CREG蛋白表達與血管損傷后RS過程中

3、平滑肌細胞增殖能力呈負相關。提示CREG基因具有促進分化、抑制增殖等使VSMCs向分化表型轉(zhuǎn)化的功能。為進一步明確CREG表達與組織器官發(fā)育的關系, 本研究采用免疫組織化學、蛋白印跡（Western blot）及逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）等方法觀察了不同小鼠胚胎發(fā)育階段和胚胎E18.5 d時各組織中CREG的表達, 以及小鼠血管發(fā)育過程中CREG的表達變化，為后續(xù)CREG的生物學功能研究提供實驗依據(jù)。 方法:

4、1 建立小鼠胚胎模型，取不同胎齡的胎鼠制備標本、HE 染色、形態(tài)學觀察。 2 以免疫組織化學染色方法，檢測CREG 蛋白在小鼠胚胎的表達時相及在不同臟器的表達定位。 3 Western blot 方法檢測不同發(fā)育時期小鼠胚胎CREG 表達變化及E18.5 d 胎鼠各臟器CREG 蛋白表達含量。 4 采用TRIZOL 法提取不同胎齡胎鼠總RNA，以RT-PCR法，檢測不同胎齡胎鼠CREG mRNA 的動態(tài)表達。

5、 5 HE 染色觀察胚胎及新生、成年小鼠血管發(fā)育的形態(tài)學變化。 6 研究發(fā)育不同時期的小鼠胚胎及新生、成年小鼠血管平滑肌分化標志蛋白SM α-actin 與CREG蛋白表達的相互關系。 7 觀察CREG 蛋白在成鼠不同臟器血管的表達變化。 結(jié)果: (1) CREG蛋白在小鼠不同胚胎發(fā)育階段的表達： CREGE5.5 d開始表達，CREG陽性細胞主要分布于原始外胚層。原腸期E6.5 d后三胚層均有CRE

6、G表達。以后隨著各組織器官的逐漸形成，CREG分布于不同組織器官，但在不同器官的表達時相并不同步。E13.5 d、E15.5 d和E18.5 d胎鼠心臟、腦、肝臟中CREG表達均為陽性，而肺、腎和小腸在E13.5 d和E15.5 d無表達，E18.5 d時各臟器表達陽性。Western blot結(jié)果顯示從E9.5 d開始，CREG表達呈明顯上升趨勢，至出生前即E18.5 d表達最高。對不同發(fā)育階段的小鼠胚胎實施RT-PCR分析顯示，E9

7、.5 d~E18.5 dCREG mRNA表達均為陽性，且表達量逐漸增高，到E18.5 d CREG mRNA表達最高，同Western blot結(jié)果相似。 (2) CREG在E18.5 d小鼠體內(nèi)的表達分布：提取E18.5 d小鼠各臟器的蛋白行Western blot分析，結(jié)果顯示, CREG在腦、心臟、肺、肝、小腸和腎等多個臟器中均有較高表達，且肺和肝臟中的表達弱于其他臟器。免疫組化觀察CREG在各臟器細胞中表達分別為腦膠質(zhì)

8、細胞、心肌細胞、肺泡上皮細胞、肝細胞、小腸粘膜細胞和腎小管細胞，呈均一的深棕色顆粒物質(zhì)分布于細胞漿內(nèi), 胞核呈陰性。 (3) 小鼠胚胎血管的形態(tài)學特征及CREG表達定位：E9.5 d血管的管壁由單層內(nèi)皮細胞構成，細胞間隙較大，腔內(nèi)可見血細胞。免疫組化結(jié)果顯示CREG表達陽性（＋＋），主要定位于血管壁單層內(nèi)皮細胞中；此時VSMCs分化標志蛋白SM α-actin表達為陰性。胚胎發(fā)育至E10.5 d，胚胎血管壁周圍開始出現(xiàn)少量雙層或

9、多層環(huán)繞排列的管壁細胞，細胞間排列松散。免疫組化染色觀察到SM α-actin蛋白陽性表達（＋），主要定位于內(nèi)皮細胞外側(cè)的管壁細胞中。同時，CREG蛋白表達陽性（＋），定位與SMα-actin蛋白一致。E12.5 d的胚胎動脈壁內(nèi)VSMCs環(huán)繞管腔呈不規(guī)則多層排列，細胞為多角形，與周圍間充質(zhì)細胞分界不明顯。免疫組化分析顯示VSMCs中SM α-actin蛋白表達（＋＋），較E10.5 d明顯增強，同時VSMCs中CREG蛋白表達（＋＋）

10、也明顯增強。胚胎E15.5 d至E18.5 d，隨著血管進一步發(fā)育，血管壁內(nèi)、中、外三層膜結(jié)構逐漸清晰，管腔增大，與周圍組織分界清楚。管壁各層細胞間排列致密，中膜VSMCs由多角形轉(zhuǎn)化為長梭形，并呈層狀排列，細胞核漿比例大。在E15.5 d胚胎血管中SMα-actin蛋白（＋＋＋）和CREG蛋白的表達（＋＋＋）均較前述各時間點明顯增強，并且CREG蛋白在血管壁內(nèi)、中和外膜三層結(jié)構細胞中均明顯表達。但胚胎發(fā)育至E18.5 d時，SM α-

11、actin蛋白（＋＋＋）仍在VSMCs中高表達，而CREG蛋白表達則下調(diào)（＋＋）。 (4) 新生及成年小鼠主動脈的形態(tài)學變化及CREG的表達：新生1 d小鼠主動脈血管壁內(nèi)、中和外膜結(jié)構清晰，管腔大且與周圍組織分界清楚。管壁各層細胞間排列緊密，VSMCs在動脈中膜層狀排列，細胞細長呈長梭形，胞核明顯，核漿比例及平均細胞直徑較大。出生28 d后，小鼠主動脈逐漸發(fā)育成熟與2 m齡成鼠主動脈的形態(tài)相似，細胞外基質(zhì)增加，VSMCs被增寬的

12、彈力膜和膠原纖維分隔形成成熟的中膜層。VSMCs核漿比例進一步縮小，細胞核近似長桿狀。出生后1 d、28 d和2 m小鼠主動脈血管壁中SM α-actin蛋白和CREG表達均為陽性（＋＋）。 (5) 不同臟器功能血管中CREG的表達：成年小鼠心、肺、脾和腎臟標本石蠟切片的CREG免疫組化分析顯示，上述臟器功能血管中CREG蛋白表達均為陽性，但表達強度不同。其中心臟冠狀動脈的CREG蛋白表達呈強陽性（＋＋＋）。而在肺小動脈、脾動脈

13、和腎臟小動脈中，CREG蛋白的表達則為弱陽性（＋），較冠狀動脈明顯降低。 結(jié)論: 1 CREG在小鼠胚胎早期E5.5 d開始表達，持續(xù)表達至出生前，表達含量逐漸增多。CREG在胚胎各臟器發(fā)生中的表達時相不同，但E18.5d時胚胎各臟器中均可見CREG蛋白表達，其表達分布與成年小鼠各臟器的表達一致。上述結(jié)果提示，CREG可能作為胚胎發(fā)育的調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育、分化和成熟過程中起重要作用。 2 CREG蛋白在小鼠胚胎