Math1誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物的耳蝸再生毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及功能學(xué)研究.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)錄因子Math1誘導(dǎo)了終末支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。1)本實(shí)驗(yàn)在描述支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為新生毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化過(guò)程的同時(shí),通過(guò)使用正常毛細(xì)胞相關(guān)特異性標(biāo)記物,在形態(tài)學(xué)方面對(duì)新生毛細(xì)胞和正常毛細(xì)胞進(jìn)行了比較;2)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡述了在Math1的作用下支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化機(jī)制;3)本實(shí)驗(yàn)在功能學(xué)方面對(duì)新生毛細(xì)胞與發(fā)育中的正常毛細(xì)胞進(jìn)行了比較,探討其是否已經(jīng)具備了正常毛細(xì)胞的功能性。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)使用了正常出生后3

2、天的新生SD大鼠耳蝸進(jìn)行體外器官培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)的過(guò)程中通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染了Math1(作用基因)和EGFP(報(bào)告基因)兩個(gè)基因(Ad5-EGFP-Math1),對(duì)照組則只轉(zhuǎn)染了EGFP(Ad5-EGFP)。首先,在轉(zhuǎn)染基因后不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)培養(yǎng)組織進(jìn)行固定,通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)標(biāo)記毛細(xì)胞相關(guān)特異性蛋白來(lái)鑒定是否有新生毛細(xì)胞的產(chǎn)生,并描述了轉(zhuǎn)分化的過(guò)程;其次,在耳蝸器官培養(yǎng)過(guò)程中,通過(guò)采用了Brdu摻入法,探討了支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化

3、機(jī)制;然后,通過(guò)檢測(cè)新生毛細(xì)胞是否有攝取耳毒性藥物新霉素,FM1-43的能力,來(lái)驗(yàn)證是否存在毛細(xì)胞特征性的機(jī)械性門(mén)控通道;最后,我們采用PatchClamp技術(shù),在不同的時(shí)間點(diǎn)對(duì)新生毛細(xì)胞的各種通道電流,動(dòng)作電位以及特征性的機(jī)械門(mén)控通道電流等在不同時(shí)間變化以及相關(guān)的動(dòng)力學(xué)分析,驗(yàn)證Math1誘導(dǎo)的新生毛細(xì)胞是否已經(jīng)具備了正常毛細(xì)胞的功能。
　　結(jié)果：①實(shí)驗(yàn)組在Ad5-EGFP-Math1轉(zhuǎn)染耳蝸組織后的第三天,開(kāi)始在小上皮嵴區(qū)域出

4、現(xiàn)了MyosinVIIA陽(yáng)性細(xì)胞,大上皮嵴區(qū)域則在轉(zhuǎn)染五天后出現(xiàn)MyosinVIIA陽(yáng)性細(xì)胞;鈣緩沖蛋白,如Calbindin,Calmodulin,Calretinin和PMCA2作為毛細(xì)胞的相關(guān)特異性標(biāo)記物,也能在異位新生毛細(xì)胞上表達(dá);Phlloidin的染色展示了新生毛細(xì)胞頂部的簇狀靜纖毛樣結(jié)構(gòu);在對(duì)照組的耳蝸的大、小上皮嵴區(qū)域則未出現(xiàn)這些現(xiàn)象;②Brdu摻入實(shí)驗(yàn)表明,支持細(xì)胞向新生毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程為直接轉(zhuǎn)分化,不依賴于支持細(xì)胞

5、的增殖;另外,Math1的表達(dá)水平是誘導(dǎo)毛細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素;③1mM的耳毒性藥物新霉素能夠引起異位新生毛細(xì)胞的死亡;從Math1轉(zhuǎn)染后5天,部分新生毛細(xì)胞開(kāi)始有能力對(duì)FM1-43的攝取,間接說(shuō)明毛細(xì)胞能通過(guò)機(jī)械門(mén)控通道攝取耳毒性藥物及FM1-43;④Math1轉(zhuǎn)染后的2天,新生毛細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)鈉電流,到第5天電流密度達(dá)最大,然后逐漸減小;對(duì)照組的支持細(xì)胞不表達(dá)鈉電流;⑤Math1轉(zhuǎn)染后三天,新生毛細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)鈣電流,電流密度隨著時(shí)間逐漸

6、增大;對(duì)照組支持細(xì)胞不表達(dá)鈣電流;⑥Math1轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細(xì)胞表達(dá)為快速失活的延遲性鉀整流,然后,表現(xiàn)為持續(xù)性基本不失活的延遲性鉀整流,且電流密度逐漸增大;而對(duì)照組的支持細(xì)胞僅表達(dá)持續(xù)不失活的幅度很小的延遲性鉀整流;⑦M(jìn)ath1轉(zhuǎn)染后五天,新生毛細(xì)胞表達(dá)了典型的HCN電流,且隨著時(shí)間電流密度逐漸減小,然后消失;⑧大多數(shù)的新生毛細(xì)胞上能記錄到誘發(fā)的動(dòng)作電位,極少數(shù)的能記錄到自發(fā)的動(dòng)作電位:⑨Math1轉(zhuǎn)染后7天,我們記錄到了新生毛細(xì)

7、胞的機(jī)械門(mén)控通道電流。
　　結(jié)論：①利用了腺病毒轉(zhuǎn)基因方式成功的建立了新生大鼠耳蝸體外培養(yǎng)在Math1誘導(dǎo)下產(chǎn)生異位新生毛細(xì)胞的模型;②新生毛細(xì)胞已經(jīng)具備正常毛細(xì)胞樣的形態(tài),并且表達(dá)許多相同的特異性相關(guān)蛋白;③支持細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛細(xì)胞的機(jī)制為直接轉(zhuǎn)分化,無(wú)需增殖后再轉(zhuǎn)分化;④新生毛細(xì)胞有能力攝取耳毒性藥物新霉素,FM1-43,間接表明機(jī)械門(mén)控通道在新生毛細(xì)胞纖毛上的存在;⑤機(jī)械門(mén)控通道電流的出現(xiàn),在功能上標(biāo)志了再生的毛細(xì)胞已經(jīng)具備了