哺乳動物細胞中EB1磷酸化的質譜鑒定及功能分析.pdf

1、末端結合蛋白EB1是一種微管正末端追蹤蛋白（+TIPs），能夠自發(fā)地定位于微管的正末端而不依賴于其它任何分子。同時，EB1作為一個平臺，還能夠將多種其他的+TIPs募集到微管的正末端。EB1由268個氨基酸殘基組成。N端是CH結構域，負責介導EB1與微管的相互作用;C端是包含有EBH結構域的卷曲螺旋結構域，負責介導EB1的二聚化，并介導EB1與其他+TIPs的相互作用;中間無定型結構的連接區(qū)將EB1的N端和C端連接起來。EB1對于微管的

2、動態(tài)性有重要調節(jié)作用，并進而參與微管介導的許多細胞活動，如細胞極化、細胞運動、細胞有絲分裂等。但是，EB1功能的調節(jié)機制還不清楚，闡明此問題有助于深入了解EB1介導的細胞活動。
　　本課題希望通過對EB1磷酸化的研究，來揭示EB1功能的調節(jié)機制。首先，本課題通過質譜的方法對在HeLa細胞系中過表達的GST-EB1蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)S27、T33、Y71、T135/S140、T154/S155/S156/S157、T165/S166

3、、T206和Y217等一系列磷酸化位點。然后，根據(jù)質譜結果的可靠性和三維晶體結構分析，本課題選擇部分位點進行進一步研究。通過點突變的方法將鑒定出來的磷酸化位點突變?yōu)椴荒芰姿峄男问胶湍M磷酸化的形式。通過生物化學和細胞生物學的實驗手段，本課題發(fā)現(xiàn)EB1磷酸化不影響EB1與微管蛋白的相互作用，而且不影響EB1定位于微管正末端的模式。通過激光共聚焦顯微鏡進行活細胞拍攝發(fā)現(xiàn)，EB1磷酸化促進微管的動態(tài)性，促進微管平均生長速度，并促進微管平均生

4、長長度。Y217磷酸化使EB1定位于微管正末端的能力減弱。Y217磷酸化還破壞EB1與MCAK、APC、CLIP170、p150Glued等+TIPs的相互作用，并破壞EB1自身二聚化的能力。但是，進一步的實驗表明，Y217磷酸化不改變細胞周期，且不影響有絲分裂紡錘體的定向和長度以及星體微管的密度。最后，我們發(fā)現(xiàn)Y217磷酸化使EB1蛋白質更穩(wěn)定。由于Y217磷酸化提高EB1單體與二聚體的比例，此結果表明EB1單體比EB1二聚體更穩(wěn)定。