大腸桿菌BL21(DE3)和MG1655的代謝特征比較.pdf

1、進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著生物科技的迅猛發(fā)展，以微生物為操作對(duì)象的代謝工程產(chǎn)業(yè)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。大腸桿菌因其有著易培養(yǎng)，遺傳背景清楚等特點(diǎn)，常被用來作為代謝工程改造的出發(fā)菌株。利用代謝工程的各種手段對(duì)大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行進(jìn)一步改造，可以使它成為生產(chǎn)各種工業(yè)原料和重要藥物的生物煉制細(xì)胞工廠。而對(duì)大腸桿菌自身的代謝網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)調(diào)控的深入研究，則為大腸桿菌的代謝工程改造提供了理論基礎(chǔ)和研究方向。
　　 大腸桿菌包含不同的種系。為了開發(fā)更適合

2、代謝工程使用的大腸桿菌菌株，本論文利用系統(tǒng)生物學(xué)的方法對(duì)比了大腸桿菌用于分子改造的K-12系列代表菌株MG1655和用于蛋白表達(dá)的B系列代表菌株BL21(DE3)在好氧和厭氧情況下的代謝特征。本論文發(fā)現(xiàn)，好氧情況下，在以葡萄糖為單一碳源的AM1培養(yǎng)基上，BL21的生長(zhǎng)速率和最終OD值都要低于MG1655。13C標(biāo)記的代謝流分析表明，BL21的TCA循環(huán)有著較大的流量，而MG1655則有著較大比例的乙酸溢出。旺盛的TCA循環(huán)可能是BL21

3、乙酸積累較少的原因之一。通過代謝流分析和基因表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn)，在這個(gè)條件下，BL21的乙醛酸支路是被抑制的，與MG1655一樣。葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)主要運(yùn)輸?shù)鞍譖tsG的敲除降低了葡萄糖在兩種菌里面的運(yùn)輸速率，同時(shí)增大了二者的TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑的流量。發(fā)生這樣變化的主要原因還有代謝調(diào)控因子Crp-cAMP在PtsG敲除后被激活，從而對(duì)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的許多基因進(jìn)行了相應(yīng)的調(diào)控。通過與未敲除ptsG前的菌株的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，ptsG基因的敲

4、除對(duì)MG1655的影響大于對(duì)BL21的影響，可能是在BL21野生菌株里面存在著某種調(diào)控機(jī)制，發(fā)揮了部分Crp-cAMP對(duì)代謝的調(diào)控作用。
　　 除了生長(zhǎng)情況，代謝流分配等代謝指標(biāo)的不同外，本論文還發(fā)現(xiàn)BL21在好氧情況下會(huì)持續(xù)分泌維生素B2—核黃素這一特點(diǎn)。文中對(duì)比了BL21和MG1655胞內(nèi)的FAD水平，發(fā)現(xiàn)在BL21中有著更高的FAD水平，這可能是核黃素積累對(duì)菌體代謝的直接影響。已知FAD是細(xì)胞氧化的一些重要酶類的配體，它的

5、量可能會(huì)影響到這些酶的數(shù)量和活性，進(jìn)而影響到TCA循環(huán)的流量大小。我們推斷核黃素的積累可能就是BL21比起MG1655的TCA循環(huán)更加旺盛的重要原因之一。通過比較由核黃素生成FMN，F(xiàn)AD的核黃素激酶/FAD合酶雙功能酶(RibF)的酶活，發(fā)現(xiàn)該酶在BL21中的酶活低于MG1655。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在BL21中有一個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變。因此我們推測(cè)在BL21中核黃素積累的原因是由于RibF的突變引起的酶活不足導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)。
　

6、　 在厭氧條件下，BL21生長(zhǎng)緩慢且不穩(wěn)定，OD值較低。經(jīng)產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)BL21的主要產(chǎn)物之一為乳酸，而MG1655的乳酸產(chǎn)量則很低。為了改善BL21在厭氧條件下的生長(zhǎng)狀況，我們?cè)贐L21中組成型表達(dá)了MG1655的丙酮酸-甲酸裂解酶pflB基因，發(fā)現(xiàn)BL21的生長(zhǎng)速率和最終OD都有了明顯的提高。這是因?yàn)樵趨捬鯒l件下，菌體生長(zhǎng)來源的ATP主要由發(fā)酵途徑的底物水平磷酸化偶聯(lián)生成。菌體代謝中乙酸的生成偶聯(lián)了1分子ATP的生成。BL21的乳酸

7、產(chǎn)量較多，而乙酸相對(duì)較少，過表達(dá)pflB后，BL21的乙酸生成增加，合成的ATP的量也提高，因此改善了BL21厭氧情況下的生長(zhǎng)。同時(shí)，ptsG的敲除解除了厭氧條件下對(duì)Crp-cAMP的抑制，提高了BL21的乙酸和琥珀酸產(chǎn)率，但是由于葡萄糖主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失，在厭氧條件下它的生長(zhǎng)仍然緩慢。
　　 本論文對(duì)大腸桿菌BL21(DE3)和MG1655自身的代謝網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)的調(diào)控機(jī)制有了一定的研究，為進(jìn)一步有針對(duì)性地利用和代謝工程改造大腸桿