皮蠅素HA基因的克隆和在大腸桿菌BL21中的表達(dá).pdf

1、廣西又尹碗去夢(mèng)禪價(jià)沈摘要HA基因是皮蠅I期幼蟲在宿主體內(nèi)移行過(guò)程中釋放出來(lái)的三種絲氨酸蛋白酶之一，對(duì)皮蠅幼蟲成熟和逃避宿主免疫系統(tǒng)起到重要作用。皮蠅素HA具有很矛的抗原性和較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，是制作重組疫苗的理想候選抗原.隨著對(duì)皮、翅丙預(yù)防和治療范圍的擴(kuò)大，以及皮蠅數(shù)量的減少，從幼蟲獲取足夠量的皮蠅素HA已變得越來(lái)越困難。因此，利用生物技術(shù)生產(chǎn)重組抗原己非常必要汾本文根據(jù)法國(guó)提供的PGEMHA克隆質(zhì)粒和HA基因的堿基序列，設(shè)計(jì)一對(duì)分別帶

2、有限制性酶切位點(diǎn)HindII和NotI的引物，利用PCR技術(shù)從PGEMHA中擴(kuò)增出HA基因，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段約為835bp將大小與預(yù)計(jì)分子量一致的DNA片段純化后連接到表達(dá)質(zhì)粒PE丁28b上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過(guò)分子量大小比較，PCR鑒定和酶切分析以及序歹。，。定、f結(jié)果表明，作者得至11的重組子(PET28bHA)中含有HA基因，而且HA基因的堿基序列完全正確。然后，將經(jīng)過(guò)鑒定

3、完全正確的陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)時(shí)相表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在加入IPTG6h后，表達(dá)量達(dá)到最高。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)NiNTA親和層析柱純化，SDSPAGE檢測(cè)為單一條帶，大小約為31KDa。經(jīng)過(guò)Westernbloting雜交實(shí)驗(yàn)，純化出來(lái)的目的蛋白能與兔抗HA的陽(yáng)性血清反應(yīng)，用gelatin作為底物，檢測(cè)其酶活性，HA融合蛋白不能降解gelatin。這些研究表明，成功構(gòu)建的PET28bHA在大腸桿菌BL21中能夠表達(dá)

4、，表達(dá)的HA融合蛋白具有反應(yīng)原性，但不具有酶活性。這些為進(jìn)一步研究HA蛋白的各種特性奠定了基礎(chǔ)。夕關(guān)健詞:皮蠅素A基因克隆蛋白表達(dá)廣西又夢(mèng)碩士夢(mèng)吞價(jià)丈一般耗牛的感染率高于黃牛。我國(guó)耗牛的平均感染率約為70%，幼年牛的感染率可達(dá)90%.感染的強(qiáng)度，每頭?？捎?20個(gè)，多者可有數(shù)百個(gè)幼蟲161牛的皮蠅感染可以造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Krull(1969)報(bào)道，山于奶牛感染皮t，產(chǎn)奶量下降25%[71Beesley(1974)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量至少

5、會(huì)減少15%[“oLudwig和Bueek(1966)證實(shí)經(jīng)過(guò)治療的皮蠅病牛日增重平均為1.03kg，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)治療的牛日增重只有。.89kg[91。而且皮蠅病能造成宿主免疫抑制(Boular1989ChabauctieNico[asGaulardet試1995)1101121，從而使宿主更易受細(xì)菌、病毒或其它寄生蟲的感染，造成的經(jīng)濟(jì)損失就很難估計(jì)了。有人預(yù)測(cè)，我國(guó)五大牧區(qū)因皮蠅病造成的損失合計(jì)約值人民幣數(shù)億元以上。由于蛇傷，受害乳牛減

6、奶約20%，菜牛出肉率減少10%。有的牛只，因“跑蜂”引起外傷，甚至摔死。更為嚴(yán)重的是由于皮蠅造成的蛇眼、蛇癱以及屠宰剝皮時(shí)造成的殘傷，嚴(yán)重地影響牛皮的質(zhì)量[‘3]。蛇眼、蛇癱多分布在牛皮的優(yōu)質(zhì)部位，尤其牛犢皮損害的面積更大，常是蛇傷累累，對(duì)牛皮出口和制革工業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。在美國(guó)，1972年因?yàn)槠は壊≡斐傻膿p失達(dá)1.92億美元(10ian1977)[419，在奧地利，1965年損失近1億先令(Kutzer198

7、4)[“1，在英國(guó)采取消滅皮蠅計(jì)劃之前，每年損失1300多萬(wàn)英鎊，希臘每年損失4200多萬(wàn)美元，意大利單因皮革損失就達(dá)1150多萬(wàn)美元(Macchioni1984)[171。此外，在我國(guó)西北、華北以及西藏等牧區(qū)，偶爾有人體病例的報(bào)道。因此，對(duì)于皮蠅病的有效控制和治療，不但對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展有很好的促進(jìn)作用，而且對(duì)制革工業(yè)的發(fā)展和人民群眾的身體健康都大有裨益。在發(fā)現(xiàn)魚藤酮之前，人們普遍采用傳統(tǒng)的手工排除皮蠅幼蟲的方法。但這種方法不但費(fèi)時(shí)，費(fèi)力