若干中心代謝途徑單基因敲除對(duì)大腸桿菌代謝影響的研究.pdf

1、人類基因組計(jì)劃的實(shí)行推動(dòng)了大腸桿菌基因組測(cè)序的完成,為大腸桿菌突變菌的構(gòu)建和代謝研究提供了遺傳學(xué)的基礎(chǔ).本文選取有代表性的中心代謝途徑單基因敲除大腸桿菌進(jìn)行考察,包括IpdA、poxB、sucA和sucC基因敲除大腸桿菌.其中,前兩個(gè)基因編碼連接糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的酶,后兩個(gè)基因編碼三羧酸循環(huán)酶.根據(jù)生長(zhǎng)特性、基因表達(dá)、酶活、胞內(nèi)代謝物濃度以及基于碳13標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的代謝通量分析來(lái)考察這些單基因敲除對(duì)大腸桿菌代謝的影響. lpd

2、A基因敲除大腸桿菌中丙酮酸脫氫酶復(fù)合體和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體均缺陷,該突變菌株的表型與野生菌有顯著不同.在LB培養(yǎng)基中,利用葡萄糖階段,葡萄糖的利用速率降低,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,由于生成大量的丙酮酸,細(xì)胞產(chǎn)率非常低;吸收丙酮酸階段,產(chǎn)生D-乳酸、乙酸、琥珀酸和L-谷氨酸.基于酶活和胞內(nèi)代謝物濃度的測(cè)量結(jié)果,發(fā)現(xiàn)丙酮酸的吸收是丙酮酸氧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸合酶.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共同作用的結(jié)果.通過(guò)丙酮酸氧化酶吸收的丙酮酸被轉(zhuǎn)化成乙酸然

3、后通過(guò)乙酰輔酶A合成酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶-乙酸激酶共同作用生成乙酰輔酶A來(lái)支持細(xì)胞的生長(zhǎng).lpdA突變菌中積累的丙酮酸在基因表達(dá)水平和酶活水平激活了D-乳酸脫氫酶,造成了D-乳酸的積累.三羧酸循環(huán)的中斷激活了乙醛酸途徑.L-谷氨酸在突變菌中的大量積累是由于其前體代謝物α-酮戊二酸的積累造成的. poxB基因敲除降低了大腸桿菌細(xì)胞的葡萄糖吸收速率、細(xì)胞生長(zhǎng)速率和生物量產(chǎn)率,升高了大腸桿菌的氧氣消耗速率和二氧化碳釋放速率.丙酮酸氧化酶

4、的缺失并沒有導(dǎo)致顯著的丙酮酸積累,從這一點(diǎn)我們可以看出,有氧條件下丙酮酸的代謝主要依賴于丙酮酸脫氫酶復(fù)合體,而丙酮酸氧化酶并不起決定作用.酶活的測(cè)定結(jié)果表明丙酮酸氧化酶的缺失導(dǎo)致了中心代謝途徑酶活的改變..poxB突變菌在合成培養(yǎng)基中葡萄糖激酶酶活上升,但是由于其它一些糖酵解酶如6-磷酸果糖激酶和1,6-二磷酸果糖醛縮酶活力的下降導(dǎo)致糖酵解途徑的代謝通量降低.在LB培養(yǎng)基中,三羧酸循環(huán)酶如檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶在.poxB突變菌中被抑

5、制.丙酮酸氧化酶的缺陷同時(shí)也導(dǎo)致了6-磷酸葡萄糖脫氫酶和乙酰輔酶A合成酶活力的升高.這說(shuō)明該酶雖然在正常大腸桿菌的代謝中不起決定作用,但還是具有一定的調(diào)節(jié)作用.特別是該酶在lpdA突變菌中起著非常重要的作用,如果在lodA突變菌中如果抑制丙酮酸氧化酶,細(xì)胞停止生長(zhǎng). sucA和sucC基因位于同一個(gè)操縱子.sucABCD,均編碼三羧酸循環(huán)酶.其中sucA參與編碼α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體,sucC參與編碼琥珀酰輔酶A合成酶.雖然.

6、sucA和sucC基因擁有這些相似點(diǎn),但是這兩個(gè)基因的缺失對(duì)大腸桿菌代謝的影響卻有很大的差異.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三羧酸循環(huán)酶的缺陷并不一定都會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率..sucA基因的缺失顯著降低了大腸桿菌的生長(zhǎng)速率,而sucC基因的缺失并沒有明顯影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率.sucA突變菌中的α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的缺失導(dǎo)致了α-酮戊二酸的積累,而在大腸桿菌中α-酮戊二酸是合成谷氨酸的代謝前體,從而導(dǎo)致谷氨酸的積累.盡管.sucC基因編碼的琥珀酰輔酶A

7、合成酶負(fù)責(zé)催化α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體的下游反應(yīng),但是并沒有導(dǎo)致α-酮戊二酸和L-谷氨酸的積累. sucA突變菌的葡萄糖吸收速率降低,乙酸的產(chǎn)量降低,并且能夠吸收利用乙酸.乙酸激酶在 sucA突變菌中活力下降直觀地解釋了該突變菌產(chǎn)生的乙酸量較少的原因,而糖酵解途徑活力的降低揭示了乙酸產(chǎn)生量減少的根本原因是下降的糖酵解途徑的代謝通量.乙醛酸途徑的顯著激活實(shí)現(xiàn)了乙酸的再利用.與之相對(duì)的是,sucC突變菌的葡萄糖吸收速率與野生菌相比并

8、沒有明顯的變化,sucC突變菌產(chǎn)生非常大量的乙酸但是并不利用產(chǎn)生的乙酸.乙酸激酶在.sucC突變菌中活力上升催化產(chǎn)生的乙酸量大大提高,乙醛酸途徑并沒有因?yàn)榇罅恳宜岬纳啥患せ?乙酸根本不可能再被吸收利用.連續(xù)發(fā)酵中,全局調(diào)控基因fadR和iclR在sucA突變菌中表達(dá)水平的降低促進(jìn)了aceA基因的表達(dá)水平的升高導(dǎo)致了乙醛酸途徑的激活,而在.sucC突變菌中表達(dá)水平的穩(wěn)定,使得aceA基因的表達(dá)水平與野生菌持平.全局調(diào)控基因arcA和f

9、nr的基因表達(dá)水平在兩個(gè)突變菌中的降低,導(dǎo)致一些三羧酸循環(huán)酶的激活. 由于三羧酸循環(huán)被中斷,.sucA和sucC突變菌的氧化還原平衡發(fā)生了變化.還原態(tài)NADH、NADPH的量減少,氧化態(tài)NAD<'+>和NADP<'+>的濃度明顯升高.這兩個(gè)突變菌中高能物質(zhì)ATP濃度均有明顯增加.根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測(cè),對(duì)于sucC突變菌,由于乙酸生成途徑是大腸桿菌中產(chǎn)生ATP的重要途徑,大量乙酸的生成同時(shí)也生成了大量的ATP.但是對(duì)于.sucA突變菌

10、,因?yàn)橐宜嵘闪拷档?所以生成大量ATP的主要途徑顯然不是乙酸的生成反應(yīng),在該突變菌中,氧化磷酸戊糖途徑的活力明顯升高,而該途徑生成的NADPH可以通過(guò)電子傳遞鏈反應(yīng)生成ATP.所以sucA和 sucC 兩個(gè)突變菌雖然表現(xiàn)出來(lái)的ATP積累的表型是相同的,但是其代謝的機(jī)理卻是截然不同的. 來(lái)源于以均勻標(biāo)記葡萄糖、首位標(biāo)記葡萄糖和天然葡萄糖的混合物為底物進(jìn)行的<'13>C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的<'1>H-<'13>C NMR 和GC-MS信號(hào)被

11、用來(lái)研究基因敲除對(duì)胞內(nèi)代謝通量分布的影響.標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的主要思想是跟蹤來(lái)源于底物的標(biāo)記碳原子,進(jìn)行基于碳原子同位素的平衡計(jì)算.已知底物分子的同位素標(biāo)記狀態(tài)和代謝反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),根據(jù)同位素的平衡,給出一組代謝通量就能夠確定中心代謝網(wǎng)絡(luò)中的中間代謝物的同位素分子的分布,也就是說(shuō)一組中間代謝物的同位素分子的分布對(duì)應(yīng)著一組代謝通量.由于氨基酸的同位素分子分布可以從他們相對(duì)應(yīng)的前體(中間代謝物)的同位素分子分布推斷出來(lái),而前體分子的標(biāo)記狀態(tài)是與代謝通量密切

12、相關(guān)的,這樣氨基酸的同位素分子分布就可以與代謝通量相關(guān)聯(lián).根據(jù)這個(gè)原理,模擬氨基酸的NMR和GC-MS信號(hào)也與代謝通量相關(guān)聯(lián).在NMR和GC-MS信號(hào)模擬過(guò)程中,要進(jìn)行三種校正,包括天然同位素豐度校正、非穩(wěn)態(tài)校正和同位素的相位校正.最優(yōu)的代謝通量分布(包括交換系數(shù))是通過(guò)最小化NMR 和GC-MS的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模擬數(shù)據(jù)之間的差別得到.首先利用MATLAB中自帶的基因算法進(jìn)行全局尋優(yōu),然后用MATLAB中局部尋優(yōu)函數(shù)或二階 Powell收斂