人AIFC-末端截短體的促細胞凋亡活性及其分子機制研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的一類疾病,常規(guī)的治療手段尚不能取得理想的效果,腫瘤基因治療作為一項新興的研究領(lǐng)域,為人類攻克這疾病帶來了新的希望和契機。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而殺滅腫瘤的思路,將會產(chǎn)生一些高效、低毒的腫瘤基因治療方案。凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis inducing factor,AIF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種線粒體相關(guān)的凋亡效應(yīng)分子,其在線粒體外空間的分布,尤其是在細胞核內(nèi)的積聚,將足以引起細胞核染色體凝集和斷裂,導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)

2、生,不受Bcl-2過表達的影響,抑制caspase的活性仍不能阻止其誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生,而且AIF在低等真核細胞凋亡以及哺乳類胚胎發(fā)育過程中具有不可或缺的作用。與caspase等其他凋亡效應(yīng)分子相比,AIF具有不受胞漿中其他凋亡抑制因子抑制,可直接誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生的優(yōu)勢。將其用于誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,可能具有重要意義。
　　本文利用PCR方法構(gòu)建了AIF截短體AIFΔ1-120、AIFΔ1-480和ΔAIF360-480,為檢測方便,在截

3、短體分子的C-末端融合了8個氨基酸殘基組成的FLAG標(biāo)簽,經(jīng)過酶切鑒定以及DNA測序證明,各載體構(gòu)建成功;瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞,Western Blot證實截短型AIFΔ1-120、AIFΔ1-480ΔAIF360-480均在轉(zhuǎn)染細胞中獲得過表達,利用激光共聚焦顯微鏡觀察異源性表達的AIF截短體分子細胞內(nèi)定位情況,發(fā)現(xiàn)去掉線粒體定位序列(MLS)但保留核定位序列(NLS)的AIFΔ1-120表達后分布在胞質(zhì)和胞核中,而同時失去MLS和N

4、LS的AIF截短體(AIFΔ1-480和ΔAIF360-480)僅僅分布在細胞質(zhì)中;瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞,經(jīng)過Annexin V、TUNEL染色、MTT、集落形成試驗等方法證實AIFΔ1-480能夠和AIFΔ1-120一樣引起細胞發(fā)生凋亡。AIF的C末端截短體分子可以引起細胞色素c從線粒體釋放至胞漿,而細胞色素c結(jié)合Apaf-1可以募集caspase-9形成凋亡體,基于這種機制,構(gòu)建了caspase-9特異性的siRNA真核表達載體,經(jīng)

5、DNA序列測定載體構(gòu)建正確,轉(zhuǎn)染HeLa細胞并用G418篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,用RT-PCR方法檢測caspase-9 mRNA水平的變化,Western Blot以及間接免疫熒光檢測caspase-9蛋白水平的改變,證實成功抑制了caspase-9的表達,將各AIF截短體瞬時轉(zhuǎn)染caspase-9表達被siRNA抑制的HeLa細胞,經(jīng)過MTT法測定細胞生長曲線,結(jié)果表明：caspase-9表達沉寂后AIFΔ1-480的促凋亡活性受到

6、抑制而AIFΔ1-120的促凋亡活性沒有受到明顯影響。在immunoAIFΔ1-120的基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的免疫促凋亡分子,包含有識別HER-2抗原的單鏈抗體scFv23、綠膿桿菌外毒素轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)域PE40和AIFC末端的融合分子,該融合蛋白呈現(xiàn)分泌表達,特異性識別殺傷HER-2陽性腫瘤細胞,而對不表達HER-2抗原的細胞不具有殺傷作用。與immunoΔAIF120分子相比,新構(gòu)建的免疫促凋亡分子分子量更小,殺傷效率可能更高,因而可能更具有應(yīng)