GDF-15誘導(dǎo)iTregs分化及其機制研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤嚴重危害著人類的健康和生命，如何治療惡性腫瘤是人類醫(yī)學(xué)所面臨的的重大難題。腫瘤免疫治療成為繼手術(shù)、放療、化療之后被逐漸認可的一種新興治療方法，然而腫瘤細胞躲避免疫細胞殺傷從而生長并進一步轉(zhuǎn)移、侵襲即腫瘤免疫逃逸是腫瘤免疫治療的最大障礙。具有抑制性功能的調(diào)節(jié)性 T細胞（Treg）在腫瘤免疫逃逸中扮演著關(guān)鍵角色[1]。我們實驗室前期通過噬菌體肽庫篩技術(shù)篩選出可與免疫細胞表面結(jié)合的一系列腫瘤源性分子，其中TGF-β超家族成員GD

2、F-15最為引起我們的關(guān)注。有研究顯示GDF-15在血清中的含量與腫瘤的分期相關(guān)[2]，且根據(jù)文獻報道，在多種腫瘤患者的外周血和腫瘤浸潤的T淋巴細胞中，Treg比例明顯升高[3]，我們課題組在前期實驗中在結(jié)直腸癌患者體內(nèi)，外周 Tregs數(shù)量與血清中GDF-15的水平隨腫瘤的惡性程度升高而增加，且首次發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清GDF-15水平與Treg比例兩者呈現(xiàn)正相關(guān)，同時，文獻報道GDF-15能夠促Foxp3表達量上調(diào)[4]，而Foxp3[5

3、]作為Treg特異的分子標志，在Treg的發(fā)育與功能中起著至關(guān)重要的作用。因此我們推測，GDF-15在iTreg的誘導(dǎo)分化中可能具有重要作用。我們擬通過實時定量PCR、流式細胞術(shù)、ELISA等實驗方法闡明GDF-15作用于na?ve CD4+T細胞使其向iTreg分化的誘導(dǎo)作用，探索GDF-15在誘導(dǎo)iTreg分化中的分子機制。
　　方法：本課題計劃從以下三方面進行研究：1、系統(tǒng)研究GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細胞fox

4、p3表達量升高。利用免疫磁珠法從人外周血中分離得到na?ve CD4+T細胞，加入 GDF-15刺激，利用 Real-time PCR及流式細胞術(shù)等實驗方法證實 GDF-15在mRNA水平上和蛋白水平上均能上調(diào)Foxp3，同時研究GDF-15對于上調(diào)foxp3有無時象特點；2、進一步確認GDF-15誘導(dǎo)后的na?ve CD4+T細胞能否向iTreg方向分化，即具有iTreg的表型和功能，我們通過實時定量PCR、ELISA和流式細胞術(shù)等實

5、驗方法分析了GDF-15刺激后的na?ve CD4+T細胞iTreg相關(guān)抑制性膜分子的表達水平，以及相關(guān)抑制性細胞因子的分泌水平。3、在進一步的GDF-15作用機制研究中，我們通過激光共聚焦、實時定量PCR、Western blot和雙熒光素酶報告基因結(jié)合生物信息學(xué)分析，分析并闡明GDF-15誘導(dǎo)na?ve CD4+T細胞向iTregs分化的分子機制。
　　結(jié)果：通過以上實驗我們得到了下列結(jié)果：1、GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve

6、CD4+T細胞foxp3表達量上調(diào)，在第一天就能觀察到foxp3表達上調(diào)，在第三天出現(xiàn)顯著變化。且在na?ve CD4+T細胞活化后兩天內(nèi)加入GDF-15刺激時，foxp3表達也可以上調(diào)，在活化兩天以后再加入GDF-15刺激后，則無法上調(diào)foxp3表達。GDF-15刺激na?ve CD4+T細胞活化后不同時間點撤去 GDF-15刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在撤去 GDF-15刺激2天后，F(xiàn)oxp3上調(diào)比例均有所下降。2、加入 GDF-15刺激后，na

7、?ve CD4+T細胞在mRNA水平和蛋白水平上均高表達 iTreg表面膜分子 CD103、CD25、GITR等。同時，ELISA實驗結(jié)果說明，抑制性細胞因子IL-10、TGF-β等在GDF-15刺激后也明顯表達上調(diào)。以上實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后na?ve CD4+T細胞具有了iTreg樣表型。3、根據(jù)文獻提示[6]，我們推測GDF-15可能通過結(jié)合TGF-βRII發(fā)揮作用。因此我們用TGF-βRII中和抗體對細胞表面的受體進行封閉，進而檢

8、測GDF-15是否依舊能夠上調(diào)Foxp3。實時定量PCR結(jié)果顯示，foxp3表達水平較未加受體抗體封閉組高，且激光共聚焦實驗結(jié)果與Real-time PCR相符，提示我們GDF-15通過TGF-βRII發(fā)揮作用。我們利用了Smad通路抑制劑SB431542以及ERK通路抑制劑PD98059對Smad通路和ERK通路分別進行阻斷，實時定量PCR結(jié)果表明，阻斷Smad通路GDF-15刺激后foxp3表達量明顯弱于GDF-15刺激組，而阻斷E

9、RK通路，GDF-15能夠更加明顯上調(diào)foxp3，Western blot結(jié)果也與實時定量PCR結(jié)果相一致。結(jié)果說明，GDF-15可以通過活化Smad通路進行信號傳導(dǎo)，加入中和抗體封閉TGF-βRII后，Smad通路活化被抑制。對于ERK通路來說，GDF-15可以抑制ERK通路的活化，TGF-β受體封閉后GDF-15對ERK通路抑制狀態(tài)也發(fā)生了部分逆轉(zhuǎn)。雙熒光素酶報告基因結(jié)果提示我們 GDF-15上調(diào) Foxp3表達的轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于

10、Foxp3啟動子的-1657bp至-1210bp處，結(jié)合生物信息學(xué)及實時定量PCR結(jié)果，我們推測GDF-15可能通過NFAT和CREB轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：GDF-15能夠誘導(dǎo)na?ve CD4+T細胞Foxp3表達上調(diào)；促進其向iTreg方向分化，同時能夠表達 iTreg相關(guān)抑制性膜分子和分泌抑制性細胞因子；間接證實了GDF-15通過與TGF-βRII結(jié)合，激活Smad通路同時抑制ERK通路從而誘導(dǎo)iTreg分化。GDF