GDF6誘導大鼠髓核間充質(zhì)干細胞分化的研究.pdf

1、背景：椎間盤退變性疾病(degenerative disc disease,DDD)引起的下腰痛是當今社會中的一種常見疾病，但目前的治療手段都屬對癥治療,無法阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變。有文獻報道在髓核組織中存在髓核間充質(zhì)干細胞，相較于其他成體間充質(zhì)干細胞來說對椎間盤的微環(huán)境更具優(yōu)勢。最近國外有研究證明一種新的生長因子—生長分化因子6（growth differentiation factor6,GDF6）能高效誘導間充質(zhì)干細胞分化為髓核樣細

2、胞，但在誘導大鼠髓核間充質(zhì)干細胞分化的研究未見報道。因此，如果能通過誘導劑GDF6，對體外培養(yǎng)的大鼠髓核間充質(zhì)干細胞進行人工干預，探討 GDF6對誘導大鼠髓核間充質(zhì)干細胞分化的影響，為尋找椎間盤退變性疾病新的治療途徑提供實驗依據(jù)。
　　目的：建立大鼠髓核間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)模型，觀察大鼠髓核間充質(zhì)干細胞的細胞學特性及生物學特性。研究生長因子GDF6對大鼠髓核間充質(zhì)干細胞分化的影響。
　　方法：1.無菌條件下取大鼠尾椎的髓核

3、組織，用Ⅱ型膠原酶消化分離椎間盤髓核組織后培養(yǎng)，胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。2.運用流式細胞術(shù)來檢測大鼠髓核間充質(zhì)干細胞的細胞表面免疫表型：CD105、CD90是否陽性表達，CD34、CD45是否陰性表達；運用RT-PCR檢測間充質(zhì)干細胞基因SOX2、Nanog的表達。3.按照培養(yǎng)條件的不同分為兩組：A：標準軟骨誘導培養(yǎng)基（不含 TGF-β3）；B：標準軟骨誘導培養(yǎng)基（不含TGF-β3）+GDF6（100ng/ml）。培養(yǎng)14天后通過熒光定

4、量PCR檢測各組細胞的KRT8、KRT18、KRT19基因的表達。
　　結(jié)果：大鼠髓核組織來源細胞在經(jīng)原代培養(yǎng)4-6天后即可見部分細胞貼壁生長，形態(tài)部分為短梭形狀，多數(shù)部分為多角形細胞，12天左右后可見部分細胞形成集落，3-4周后細胞融合可達90％。傳代后細胞增殖明顯加快，約一周左右即可再次傳代，梭形細胞開始增多。到第三代時可見細胞大多為長梭形，待細胞達到90%融合時，可見細胞呈漩渦狀生長。通過流式細胞術(shù)檢測所培養(yǎng)細胞的表面免疫分

5、子標志：CD105、CD90陽性表達，CD34、CD45陰性表達；運用 RT-PCR檢測所培養(yǎng)細胞可表達干細胞基因SOX-2、Nanog。經(jīng)GDF6誘導分化后，通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)誘導組較對照組細胞的 KRT8、KRT18、KRT19基因的表達明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.本實驗成功的在體外分離培養(yǎng)出大鼠髓核間充質(zhì)干細胞。2.GDF6具有誘導大鼠髓核間充質(zhì)干細胞向類髓核細胞分化的作用，為髓核間充質(zhì)干