生長(zhǎng)分化因子15(GDF-15)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管新生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　觀察rh-GDF-15干預(yù)對(duì)缺氧的人源臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡及血管新生的影響,探討其作用機(jī)制。
　　方法:
　　HUVECs取自健康的剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶,經(jīng)分離、培養(yǎng)獲得;
　　通過(guò)化學(xué)缺氧的方法模擬體內(nèi)心肌缺血時(shí)的組織缺氧環(huán)境;
　　用PCR法測(cè)定需要檢測(cè)的基因(mRNA),用western blot.檢測(cè)需要檢測(cè)的蛋白表達(dá)水平,用ELISA法測(cè)定HUVECs上清液中G

2、DF-15因子濃度;
　　檢測(cè)在缺氧(0、2、6、12、24、36、48h)時(shí)HUVECs細(xì)胞中GDF-15基因和蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞上清液中GDF-15因子濃度;
　　觀察rh-GDF-15(0、10、20、50ng/ml)預(yù)處理對(duì)缺氧24h時(shí)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響;
　　觀察rh-GDF-15(0、10、20、50ng/ml)預(yù)處理對(duì)HUVECs細(xì)胞缺氧24h時(shí)形成管腔樣結(jié)構(gòu)的影響;
　　測(cè)定不同濃度rh-

3、GDF-15(0、10、20、50ng/ml)預(yù)處理缺氧24hHUVECs細(xì)胞Bcl-2、p53蛋白及VEGF和VEGFR2基因表達(dá)水平;
　　測(cè)定缺氧不同階段(0、2、6、12、24、36、48h)和rh-GDF-15(0、50ng/ml)預(yù)處理?xiàng)l件下HUVCEs胞漿中HIF-1α蛋白表達(dá)水平;
　　分別測(cè)定rh-GDF-15(50ng/ml)及PBS預(yù)處理HUVECs,在缺氧不同階段(0、12、24、48h)細(xì)胞漿及細(xì)胞

4、核內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)水平;
　　觀察常氧及缺氧24h狀態(tài)下,PBS、rh-GDF-15(50ng/ml)、HIF-1αsiRNA和HIF-1αsiRNA+rh-GDF-15(50ng/ml)預(yù)處理后HUVECs在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)的結(jié)果;
　　檢測(cè)HUVECs缺氧24h、rh-GDF-15(50ng/ml)和rh-GDF-15(50ng/ml)+HIF-1αsiRNA預(yù)處理后VEGF基因及蛋白及

5、VEGFR2蛋白表達(dá)水平;
　　觀察rh-GDF-15(0、50ng/ml)干預(yù)、缺氧24h及常氧條件下HUVECs細(xì)胞 Sirtl和Mdm2蛋白表達(dá)水平;rh-GDF-15(50ng/ml)及nutlin-3(Mdm2的特異性拮抗劑)預(yù)處理、HUVECs在不同缺氧時(shí)間點(diǎn)胞漿及胞核內(nèi)p53表達(dá)水平;
　　觀察rh-GDF-15(50ng/ml)、nutlin-3(10μmol/L(Mdm2的特異性拮抗劑)及rh-GDF-15

6、(50ng/ml)+nutlin-3預(yù)處理、HUVECs缺氧24h條件下Mdm2-p53免疫復(fù)和物、不同缺氧時(shí)間點(diǎn)(0、2、6、12、24h)胞漿和胞核內(nèi)p53、缺氧6h后HIF-1α蛋白和VEGF基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、HUVECs在缺氧2h時(shí)細(xì)胞中GDF-15的mRNA水平較0h、6h、12h、24h、36h、48h顯著上調(diào)(p<0.05),隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng),表達(dá)水平逐漸下調(diào)(灰度比分別為0.77±0.08 v

7、s0.22±0.04、0.33±0.09、0.35±0.04、0.29±0.09、0.19±0.06、0.15±0.04);缺氧2h、6h時(shí)細(xì)胞中蛋白水平較0h、12h、24h、36h、48h明顯升高(p<0.05),隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),蛋白水平逐漸下調(diào),(灰度比分別為0.36±0.04、0.30±0.00 vs0.06±0.00、0.15±0.02、0.10±0.03、0.09±0.02、0.06±0.01,p<0.05);細(xì)胞上清液中

8、GDF-15水平缺氧2h組較0h、12h、24h、36h、48h顯著上調(diào)(p<0.05),隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),逐漸下調(diào),(灰度比分別為11.93±1.55 vs3.43±0.76、4.73±0.76、4.6±1.3、4.0±0.56、3.43±1.04,p<0.05)。
　　2、用rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL)不同濃度預(yù)處理組HUVECs缺氧24h時(shí)細(xì)胞凋亡指數(shù)分別是(22.0±3

9、.16)％、(17.8±3.90)％、(15.6±5.68)％、(13.4±3.58)％,提示rh-GDF-15預(yù)處理可減少HUVECs缺氧24h時(shí)細(xì)胞凋亡,且呈濃度依賴性;隨濃度增加,凋亡指數(shù)逐漸減少,rh-GDF-15(50ng/mL)組較不加rh-GDF-15組凋亡指數(shù)有顯著性差異{(22.0±3.16)％vs(13.4±3.58)％, p<0.05};
　　3、缺氧24h時(shí)HUVECs在Matrial Matrix上幾乎無(wú)

10、管腔樣結(jié)構(gòu),用不同濃度rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL)預(yù)處理后出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu),隨著rh-GDF-15濃度增大,形成的管腔樣結(jié)構(gòu)越明顯、越多。rh-GDF-15(20ng/mL和50ng/mL)組較(0ng/mL)組有明顯差異(5.67±0.58、7.00±1.00vs1.00±1.00,p<0.05;)
　　4、不同濃度rh-GDF-15(0ng/mL、10ng/mL、20ng/m

11、L、50ng/mL)預(yù)處理缺氧24hHUVECs細(xì)胞Bcl-2表達(dá)上調(diào),呈濃度依賴性,rh-GDF-15(50ng/mL)組灰度比較(0ng/mL)組有顯著性差異(0.79±0.22 vs0.51±0.12,p<0.05); VEGF表達(dá)上調(diào),且呈劑量依賴,rh-GDF-15(50ng/mL)組較(0ng/mL)組有顯著性差異(0.67±0.06 vs0.14±0.06,p<0.05);而p53蛋白表達(dá)下調(diào)亦呈濃度依賴性,rh-GDF-

12、15(50ng/mL)組較(0ng/mL)組有顯著性差異(0.38±0.06vs0.74±0.19,p<0.05);VEGFR2基因表達(dá)無(wú)明顯變化;
　　5、缺氧2h時(shí)胞漿HIF-1α蛋白表達(dá)較缺氧前顯著增加(灰度比0.67±0.12vs0.38±0.10,p<0.05);隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng),HIF-1α蛋白表達(dá)逐漸減少,至12h時(shí)已低于缺氧前水平。用rh-GDF-15預(yù)處理后缺氧HUVECs胞漿內(nèi) HIF-1α表達(dá)雖隨時(shí)間延長(zhǎng)而有

13、減少的趨勢(shì),但在24h、36h、48h時(shí)較未用rh-GDF-15預(yù)處理組比較有顯著性差異(灰度比0.49±0.13vs0.19±0.09,0.42±0.08vs0.12±0.05,0.37±0.10vs0.07±0.03,p均<0.05);用rh-GDF-15預(yù)處理后,缺氧HUVECs胞核內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào),各個(gè)時(shí)間段比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,(灰度比0.16±0.03 vs0.04±0.02,0.33±0.02vs0.0

14、3±0.01,0.43±0.03vs0.05±0.02,0.29±0.02 vs0.04±0.01,p均<0.05);
　　6、缺氧HUVEC經(jīng)rh-GDF-15預(yù)處理后在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu);加入HIF-1αsiRNA及加入HIF-1αsiRNA+rh-GDF-15后,均未在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)。
　　7、HUVECs缺氧24h條件下、rh-GDF-15(50ng/ml)+H

15、IF-1αsiRNA干預(yù)后VEGF轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著低于單用rh-GDF-15(50ng/ml)干預(yù)(灰度比比較分別為0.19±0.02VS0.60±0.01,0.0800±0.01604vs0.1871±0.01694,p<0.05);而VEGFR2蛋白表達(dá)水平兩組無(wú)顯著差別,
　　8、常氧條件下rh-GDF-15(50ng/ml)預(yù)處理,HUVECs細(xì)胞Sirtl和Mdm2表達(dá)水平與未預(yù)處理組無(wú)顯著差異;在缺氧條件下rh-GD

16、F-15(50ng/ml)預(yù)處理使Mdm2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(灰度比0.6912±0.02732vs0.5405±0.05291,p<0.05),而Sirtl表達(dá)水平無(wú)顯著差異;
　　9、rh-GDF-15(50ng/ml)預(yù)處理、HUVECs缺氧24h條件下胞漿內(nèi)p53表達(dá)上調(diào),而胞核內(nèi)p53表達(dá)下調(diào),用nutlin-3預(yù)處理,HUVECs缺氧條件下胞漿內(nèi)p53表達(dá)下調(diào),而胞核內(nèi)p53表達(dá)上調(diào);
　　10、免疫共沉淀結(jié)果

17、顯示HUVECs在缺氧24h后,細(xì)胞內(nèi)P53蛋白與Mdm2蛋白存在相互關(guān)系,經(jīng)過(guò)rh-GDF-15(50ng/ml)預(yù)處理后P53與Mdm2形成復(fù)合物增加,同時(shí)HIF-1α及VEGF的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)、但是使用nutlin-3及rh-GDF-15(50ng/ml)+nutlin-3預(yù)處理后Mdm2-p53免疫復(fù)和物、HIF-1α及VEGF表達(dá)下調(diào);
　　結(jié)論：
　　1、GDF-15可明顯抑制缺氧狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)內(nèi)