新生大鼠腦干耳蝸核存在神經(jīng)前體細(xì)胞的初步證據(jù).pdf

1、感音神經(jīng)性聾是臨床常見病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，臨床上尚無理想的治療方法。目前關(guān)于感音神經(jīng)性聾的防治研究已成為聽力學(xué)和耳科學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。近年來，運(yùn)用胚胎或神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）以及（neuralprogenitorcells，NPCs）的替代治療應(yīng)運(yùn)而生，并受到密切的關(guān)注。目前大量的研究致力于干細(xì)胞/前體細(xì)胞移植促進(jìn)聽覺功能恢復(fù)，研究方向主要集中于外源性NSCs的直接或定向誘導(dǎo)后移植，

2、或者將NSCs作為外源性基因的載體進(jìn)行移植。雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者在此方面已經(jīng)進(jìn)行了很多工作，取得了一定的進(jìn)展，但仍有很多難題亟待解決。其關(guān)鍵問題之一是：對(duì)于NSCs/NPCs在聽功能的形成與發(fā)育過程中的作用，尤其是聽覺中樞神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)是否存在多向分化潛能的NSCs/NPCs還不甚清楚。
　　實(shí)驗(yàn)一：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：目前聽覺系統(tǒng)是否存在NSCs/NPCs的研究主要集中在內(nèi)耳感受神經(jīng)元的干細(xì)胞/前體

3、細(xì)胞上，近年研究證實(shí)哺乳動(dòng)物內(nèi)耳中存在著一定數(shù)量毛細(xì)胞的前體細(xì)胞，而聽覺中樞神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)是否存在多向分化潛能的NSCs/NPCs目前尚未見報(bào)道。本研究擬分離、培養(yǎng)新生大鼠腦干耳蝸核NPCs，觀察其增殖及傳代特性，建立新生大鼠腦干耳蝸核NPCs的培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。方法：P1、P3、P5、P7、P9、P11以及成年SD成年大鼠麻醉后，75％酒精消毒，無菌條件下開顱切取腦干耳蝸核，經(jīng)剪碎、消化、離心、洗滌、吹打、過濾、計(jì)數(shù)，接種于

4、無血清培養(yǎng)液DMEM/F12(11)∶培養(yǎng)，內(nèi)含B27(150)∶、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF，置于5％CO2培養(yǎng)箱(37℃)內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞每5～7d傳代1次。取次代神經(jīng)球離心后消化，吹打成單細(xì)胞懸液，通過“有限稀釋法”獲得從一個(gè)單細(xì)胞克隆擴(kuò)增出的大量均質(zhì)的腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”。采取免疫熒光、免疫組織化學(xué)的方法，對(duì)NSCs/NPCs的特異性標(biāo)記物Nestin、Musas

5、hi1的表達(dá)進(jìn)行鑒定；通過臺(tái)盼藍(lán)染色技術(shù)檢測(cè)不同日齡組細(xì)胞活力；CCK-8法繪制不同日齡組生長(zhǎng)曲線，觀察不同生長(zhǎng)因子對(duì)于細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：新生5-7日齡大鼠腦干耳蝸核可以分離培養(yǎng)“神經(jīng)前體細(xì)胞”，體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球，并保持旺盛的增殖活力，可持續(xù)傳代100代以上；這些細(xì)胞經(jīng)稀釋純化、傳代后可以繼續(xù)形成細(xì)胞克隆。細(xì)胞克隆呈nestin、musashil1免疫反應(yīng)陽性；5-7日齡大鼠腦干耳蝸核中“神經(jīng)前體細(xì)胞”數(shù)量較多，增殖能力旺盛，

6、而在小于5日齡與大于9日齡大鼠中該細(xì)胞數(shù)量很少，而且增殖能力差，很難連續(xù)傳代。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）聯(lián)合應(yīng)用可以明顯促進(jìn)耳蝸核中的“神經(jīng)前體細(xì)胞”的傳代、增殖。結(jié)論：從新生5-7日齡大鼠腦干耳蝸核可以分離、培養(yǎng)出具有長(zhǎng)期自我更新、維持自身數(shù)量穩(wěn)定、保持未分化狀態(tài)進(jìn)行傳代分裂增殖的具有部分NSCs特性的“神經(jīng)前體細(xì)胞”。
　　實(shí)驗(yàn)二：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細(xì)胞體外分化特性的對(duì)比研究
　　

7、目的：在實(shí)驗(yàn)一中，我們?cè)谛律?-7日大鼠的腦干耳蝸核中分離出了具有體外連續(xù)傳代增殖能力的“神經(jīng)前體細(xì)胞”，這些細(xì)胞體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球，并表達(dá)NSCs/NPCs的特異性抗體，但還沒有證實(shí)其是否存在NSCs/NPCs的另一個(gè)重要的特性——多向分化潛能。本實(shí)驗(yàn)擬通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光、分子生物學(xué)的方法，驗(yàn)證該細(xì)胞的體外多向分化能力，觀察分析其分化特性，并比較其與嗅球NSCs、嗅上皮NSCs分化特性的差異。方法：三種細(xì)胞分別取材培養(yǎng)，進(jìn)

8、行體外誘導(dǎo)分化后免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光化學(xué)以及分子生物學(xué)的鑒定；進(jìn)行細(xì)胞的BrdU的體外標(biāo)記，觀察增殖與分化情況。結(jié)果：我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大部分細(xì)胞分化為NeuN免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元和GFAP免疫反應(yīng)陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，少部分細(xì)胞分化為GalC免疫反應(yīng)陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞；標(biāo)記后大部分細(xì)胞均為BrdU陽性，表明其處于增殖期，通過對(duì)三種來源細(xì)胞BrdU陽性率的比較可以發(fā)現(xiàn)，嗅球來源與耳蝸核來源的細(xì)胞BrdU的陽性率相近，均高于嗅上皮來源的N

9、SCs。這可能由于不同腦區(qū)的發(fā)育特性導(dǎo)致其干細(xì)胞增殖能力不同。結(jié)論：新生大鼠腦干耳蝸核中的這種“神經(jīng)前體細(xì)胞”具有了體外多向分化的潛能。
　　實(shí)驗(yàn)三：新生大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究
　　目的：了解大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞之間的聯(lián)系以及細(xì)胞的增殖和發(fā)育狀態(tài)，有助于闡明該細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等生物學(xué)行為，為該細(xì)胞的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：本研究在成功分離、培養(yǎng)新生大鼠腦干耳

10、蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”的基礎(chǔ)上，應(yīng)用掃描及透射電子顯微鏡觀察新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”的生物學(xué)特征，以期為更深層次的研究和應(yīng)用提供依據(jù)。結(jié)果：體外培養(yǎng)的NSCs呈圓形或橢圓形，表面有微突起或微絨毛，細(xì)胞核漿比例高，稀少的細(xì)胞漿中有多少不等的未成熟線粒體、核糖體及高爾基復(fù)合體。不同培養(yǎng)時(shí)期的神經(jīng)球內(nèi)未分化NSCs的結(jié)構(gòu)大致相同，均有分裂增殖細(xì)胞及少數(shù)凋亡細(xì)胞。分化后細(xì)胞伸出樹突

11、、軸突樣結(jié)構(gòu)，相鄰細(xì)胞之間有突觸樣組織。結(jié)論：電鏡提示耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”具有原始細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，分化后的細(xì)胞均有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)四大鼠腦干耳蝸核神經(jīng)前體細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
　　目的：NSCs在神經(jīng)組織中含量少，獲取大量純化NSCs是研究工作的基礎(chǔ)。NSCs在體外的合理凍存與復(fù)蘇及無損保存是NSCs研究的關(guān)鍵。建立一種能夠長(zhǎng)期儲(chǔ)存并維持NSCs生物學(xué)特性的方法對(duì)促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)的基礎(chǔ)和臨床移植的研究具有重要的意

12、義。方法：我們應(yīng)用不同凍存保護(hù)液對(duì)新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”進(jìn)行凍存，研究低溫凍存對(duì)該細(xì)胞的增殖及多向分化潛能的影響，并以胚胎大鼠嗅球神經(jīng)干細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行研究，分析凍存與復(fù)蘇對(duì)于新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”生物學(xué)特性的影響。結(jié)果：采取正確的凍存與復(fù)蘇方法，對(duì)新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”的生物學(xué)特性無影響。結(jié)論：新生大鼠腦干耳蝸核“神經(jīng)前體細(xì)胞”經(jīng)低溫長(zhǎng)期凍存，復(fù)蘇后對(duì)于該細(xì)胞的基本生物學(xué)特性沒有明顯影響，可以長(zhǎng)期低