酒精對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 胎兒酒精綜合癥(fetal alcohol syndrome，F(xiàn)AS)是由于父母雙方飲酒尤其是婦女孕前、孕期飲酒造成的子代出生缺陷，大量研究己證實(shí)孕期酒精暴露會(huì)影響胎兒的生長和發(fā)育，主要表現(xiàn)為包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各種器官畸形。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期，神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cells)對(duì)酒精非常敏感，特別是胎兒出生前3個(gè)月，短暫的酒精接觸就能引起神經(jīng)元的大量死亡，而此時(shí)也是神經(jīng)元突觸形成的時(shí)期。

2、對(duì)酒精大鼠模型的研究證明，胎兒期接觸酒精，會(huì)使發(fā)育中的大腦皮質(zhì)層神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖能力降低，減少神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。孕13天胎鼠神經(jīng)上皮主要由神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞組成，統(tǒng)一地稱之為神經(jīng)前體細(xì)胞。同時(shí)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)元類似細(xì)胞系及星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明，酒精能顯著抑制上述細(xì)胞的增殖、降低細(xì)胞存活率。最近的體外研究發(fā)現(xiàn)，酒精可以導(dǎo)致大鼠大腦皮層前體細(xì)胞和小腦前體細(xì)胞周期延遲和大量細(xì)胞死亡。目前為止，酒精對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)致畸的機(jī)制了解很少，特別是酒精對(duì)神

3、經(jīng)前體細(xì)胞的影響僅見國外幾篇文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，國內(nèi)尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。 研究目的： 建立穩(wěn)定的貼壁培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞方法和體外研究酒精損傷神經(jīng)前體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；進(jìn)一步研究酒精對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響，研究M型乙酰膽堿受體(mAChR)介導(dǎo)的信號(hào)通路在神經(jīng)前體細(xì)胞增殖過程中的作用及酒精對(duì)其影響；為揭示酒精對(duì)腦發(fā)育過程中神經(jīng)前體細(xì)胞的毒性作用機(jī)制及其防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)控制胎兒酒精綜合癥發(fā)生、降低智力低下兒童出生率，提高我國人口素質(zhì)具有

4、重要意義。 實(shí)驗(yàn)方法： 從孕13天胎鼠端腦分離神經(jīng)前體細(xì)胞，用本實(shí)驗(yàn)室建立的貼壁培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞方法培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 1.神經(jīng)前體細(xì)胞的鑒定及純度分析： (1)原代貼壁培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞5天后，用Nestin抗體進(jìn)行免疫熒光染色標(biāo)記神經(jīng)前體細(xì)胞，DAPI熒光染料復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察，拍照，計(jì)算神經(jīng)前體細(xì)胞純度。 (2)將BrdU摻入神經(jīng)前體細(xì)胞，用抗Nestin、BrdU熒光抗體進(jìn)行雙標(biāo)

5、記，DAPI復(fù)染方法，分析貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力。 (3)神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)5天后，去除bFGF和EGF，繼續(xù)培養(yǎng)5天，分別進(jìn)行MAP<,2>和GFAP免疫熒光染色，檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的能力。 (4)采用神經(jīng)前體懸浮培養(yǎng)方法培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞，培養(yǎng)5天后，對(duì)克隆球細(xì)胞進(jìn)行’Nestin、DAPI免疫熒光雙染，與貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)前體細(xì)胞純度進(jìn)行分析對(duì)比。 2、研究酒精對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖

6、、凋亡和壞死的影響： (1)神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)5天后，加入不同濃度酒精作用24 h，0．125﹪胰蛋白酶消化細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，分析不同濃度的酒精對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞壞死的影響。(2)貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)前體細(xì)胞，酒精作用24 h，在作用結(jié)束前4 h加入BrdU。摻入到細(xì)胞中的BrdU用Cy3連接的BrdU抗體標(biāo)記、DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡觀察，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。 (3)用MTT檢測(cè)法分析不同濃度酒精(0、25、50、100 m

7、mol/L)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞存活能力的影響。 (4)使用熒光探針碘化丙啶(PI)和Ho．33342雙染色方法從形態(tài)學(xué)觀察分析酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡和壞死情況。 (6)用MTT檢測(cè)方法分析不同濃度的酒精代謝產(chǎn)物乙醛(0、0．5、2、8 mmol/L)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞活性的影響。 3、mAchRs介導(dǎo)的信號(hào)通路在神經(jīng)前體細(xì)胞增殖過程的作用及酒精對(duì)其影響： (1)用MTT檢測(cè)方法分析不同濃度的mAchRs激動(dòng)劑

8、卡巴可(Carbachol，CCh)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響。 (2)用形態(tài)學(xué)觀察和MTT檢測(cè)的方法觀察分析酒精(100mM)和阿托品(50μM)對(duì)卡巴可誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的影響。 (3)采用磷酸化：Erkl/2抗體標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法定量分析酒精對(duì)卡巴可誘導(dǎo)的MAPK磷酸化表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．貼壁培養(yǎng)5天的神經(jīng)前體細(xì)胞純度達(dá)97﹪，絕大多數(shù)細(xì)胞保持未分化狀態(tài)，并有增殖能力，增殖指數(shù)達(dá)51.8

9、﹪；去除生長因子后，神經(jīng)前體細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞； 2．中、低等濃度的酒精(25～50 mmol/L)能抑制神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。高濃度的酒精(100 mmol/L)能顯著降低神經(jīng)前體細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞存活率降至68.1﹪，細(xì)胞增殖指數(shù)僅為16.1﹪，并呈劑量依賴效應(yīng)。 3．0.5～2 mmol/L的乙醛對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞影響并不明顯，高濃度乙醛(8 mmol/L)可以顯著降低細(xì)胞存活率至59.7﹪． 4．低、

10、中濃度(25～50mM)的酒精短時(shí)間作用對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的影響并不明顯，高濃度的酒精(100mM)能顯著誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡和死亡。 5．體外培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞加入不同濃度的卡巴可(mAchRs激動(dòng)劑)作用48h后，神經(jīng)前體細(xì)胞增殖迅速，以100μmol/L卡巴可最為明顯。 6．100raM酒精和50gM阿托品(mAchRs非特異性阻斷劑)能顯著抑制卡巴可的促神經(jīng)前體細(xì)胞增殖作用。 7．卡巴可激活mAchRs后，使

11、用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的磷酸化ERKl/2增加；而100mM的酒精和MEK抑制劑PD98059能顯著抑制這種增強(qiáng)的熒光信號(hào)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1．成功建立了貼壁培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞的方法和研究酒精對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖影響的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2．酒精能顯著抑制神經(jīng)前體細(xì)胞增殖。 3．酒精能夠誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞凋亡和壞死。 4．酒精代謝產(chǎn)物乙醛能降低神經(jīng)前體細(xì)胞存活率。 5．卡巴可明顯刺激神經(jīng)前體細(xì)胞增