microRNA在耳蝸前體細胞增殖和分化中的作用探討.pdf

1、在耳科學領域，探索耳蝸的發(fā)育機制和毛細胞的再生機制是兩個具有挑戰(zhàn)性的難題。在新生的鼠類耳蝸內，仍然能夠分離和培養(yǎng)出具有增殖能力的前體細胞，這些耳蝸前體細胞（CPCs）在體外能夠分化出耳蝸毛細胞以及其他種類的耳蝸細胞。這些前體細胞被認為可能應用于毛細胞損傷缺失后的替代治療，更重要的是，在體外誘導分化這些前體細胞可以為我們提供一個研究耳蝸發(fā)育和毛細胞再生的體外模型。
　　microRNA（miRNA）是一類能夠調節(jié)細胞增殖、分化以及干

2、細胞命運的內源性非編碼小RNA。目前尚無關于miRNA在耳蝸前體細胞增殖和分化中表達和功能的研究。在本研究中，我們首次利用微芯片及實時定量PCR等技術發(fā)現(xiàn)了在CPCs分化過程中表達的全部miRNA及其表達模式，與神經干細胞(NSCs)比較后，發(fā)現(xiàn)miR-183家族具有CPC細胞表達特異性。這些結果表明miRNA可能在CPC的增殖和分化中發(fā)揮了不同的作用，還可能決定了CPC向毛細胞的定向分化。
　　使CPCs過表達目的miRNA或目

3、的miRNA的互補反義鏈可以分別通過“gain-of-function”和“l(fā)oss-of-function”實現(xiàn)對miRNA功能的驗證。但目前尚無成功轉染CPCs的相關報道。我們首次觀察和比較了三種不同的轉染方法對CPCs的轉染率和對細胞存活率的影響。初步證明了腺病毒介導的基因轉導是使耳蝸前體細胞過表達目的基因的最佳途徑與方法。
　　實驗一：耳蝸前體細胞和神經干細胞的分離培養(yǎng)和分化
　　目的：分離、培養(yǎng)新生大鼠仔鼠耳蝸中的

4、前體細胞（cochlear progenitor cells，CPCs）和胚胎鼠中來源于嗅球部位的神經干細胞(neural stem cells,NSCs)，并對兩種細胞進行體外誘導分化。
　　方法：從新生0至3天的大鼠耳蝸基底膜中分離出CPCs，進行原代培養(yǎng)，分別用免疫細胞熒光和免疫細胞化學方法檢測BrdU和nestin在CPCs中的表達情況，鑒定前體細胞的增殖能力和細胞特性。用血清誘導前體細胞分化，用免疫細胞熒光的方法檢測CP

5、Cs是否具有分化成毛細胞的能力。從發(fā)育15天的SD大鼠胚胎鼠的嗅球中分離出NSCs，并進行傳代培養(yǎng)。用血清誘導傳代第4代的NSCs進行分化。
　　結果：原代培養(yǎng)的CPCs第18小時后可見少量細胞球形成，隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細胞球數量逐漸增多，組成細胞球的細胞數目也增多。細胞球內絕大部分細胞BrdU和nestin陽性。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞球的形態(tài)發(fā)生改變，增殖能力明顯下降，而且部分細胞球自行貼壁，無法進行嚴格意義上的傳代。經

6、分化誘導后，細胞球貼壁生長，14天后，對分化細胞行免疫熒光化學染色，發(fā)現(xiàn)部分細胞表達毛細胞標志物myosinVIIA。NSCs增殖能力非常強，可傳至少40代，持續(xù)6個月，分化后的細胞形態(tài)與CPCs來源的分化細胞顯著不同。
　　結論：本部分實驗表明CPCs具有一定的增殖能力，也可以分化出毛細胞樣細胞，但并非嚴格意義上的干細胞，只能稱其為耳蝸來源的前體細胞，它可作為耳蝸發(fā)育和毛細胞再生的體外研究模型。本部分實驗為研究和比較miRNA在

7、CPCs和NSCs分化過程中的表達變化奠定基礎。
　　實驗二：耳蝸前體細胞分化過程中miRNA的表達變化
　　目的：miRNA具有調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和影響細胞命運的重要作用。目前關于miRNA在CPCs中的表達和功能研究尚未見任何報道。我們擬用高通量的miRNA芯片檢測目前已知所有的miRNA在CPCs增殖和分化過程中的表達模式。
　　方法：收集CPCs細胞球和CPCs來源的分化6天和14天的細胞，提取總RNA，

8、通過質量檢測后用Hy3標記探針，用LNAmiRNA芯片進行雜交，然后掃描芯片并分析所有目前已知的miRNA的表達熒光信號強度，經過信號標準化和數據處理后繪制miRNA的表達模式圖。分析并比較每個miRNA在三個時間點的表達變化。
　　結果：近有100個miRNA在CPCs的分化過程中可以檢測到。隨著分化的進行，大部分的miRNA都出現(xiàn)明顯的表達變化。這些miRNA之間的表達豐度跨度巨大，而且具有不同的表達模式，miR-125b-5

9、p,miR-494和miR-22是表達量最高的三個miRNA。在檢測到的miRNA中，最為常見的三種表達模式是：1.在未分化狀態(tài)下表達水平達到峰值;2.在分化第6天的時候表達水平達到峰值;3.在分化第14天的時候表達水平達到峰值。
　　結論：本部分實驗表明在CPCs不同分化階段，具有不同的miRNA表達譜系。miRNA表達水平的時序性調節(jié)變化暗示著這些miRNA在不同的分化階段發(fā)揮不同的作用。
　　實驗三：實時定量PCR技術

10、比較miRNA在不同種類細胞中的表達模式
　　目的：用miRNA時實定量RT-PCR技術驗證芯片結果，檢測miR-21、miR-503、let-7a和let-7f及miR-183家族在CPCs分化過程中的表達變化，檢測miR-183家族在NSCs分化過程中的表達變化。對比miR-183家族在兩種細胞中的表達情況。
　　方法：收集CPCs細胞球和CPCs來源的分化6天和14天的細胞，提取總RNA，用miRNAqRT-PCR技術

11、檢測miR-21、miR-503、let-7a、let-7f、miR-96、miR-182和miR-183在三個分化時間點的表達變化。收集NSCs細胞球和NSCs來源的分化6天和14天的細胞，提取總RNA，用miRNAqRT-PCR技術檢測miR-183家庭在三個分化時間點的表達變化。
　　結果：miR-21、miR-503、let-7a和let-7f的表達趨勢與其在miRNA芯片中的結果基本一致。miR-21、let-7a和le

12、t-7f具有相似的表達模式，均在分化6天的時候達到峰值。而miR-503具有不同的表達模式，隨著分化的進行，miR-503的表達水平逐漸升高，在分化第14天階段表達水平達到高峰，此變化亦具有統(tǒng)計學意義。miR-183家族的三個成員表達模式不同，miR-96和miR-182的表達量均隨著分化的進行不斷下降，而miR-183的表達與miR-21相似在分化6天時達到高峰。miR-96和miR-183均無法在NSCs分化過程中檢測到，miR-1

13、82僅能在未分化的NSCs中檢測到，但表達量極低。經統(tǒng)計學檢測，以上變化均具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：本部分實驗結果表明了LNA芯片結果的可靠性。在CPCs分化中不同的miRNA可能有類似的功能。miR-183家族具有CPC的細胞表達特異性，這種特導性可能影響了干細胞向CPCs的分化，也可能決定了CPCs向多種耳蝸細胞的特異性分化。
　　實驗四：耳蝸前體細胞過表達目的基因方法的建立
　　目的：能夠使CPCs過表達或低表

14、達miRNA是驗證miRNA功能的首要條件。但目前尚無成功轉染CPCs的相關報道。我們分別觀察脂質體轉染、電穿孔轉染和腺病毒感染三種方法對原代培養(yǎng)的CPCs的轉染率。為日后研究miRNA在CPCs中發(fā)揮的作用奠定實驗技術基礎。
　　方法：用不同比例的EGFP質粒/脂質體復合物和不同的孵育時間轉染CPCs;設置不同的電場強度用電穿孔轉染法將EGFP質粒轉染入CPCs;按照不同MOI值加入rAd-EGFP，用腺病毒介導的方法使CPCs

15、表達EGFP。24小時后在熒光顯微鏡下計數陽性細胞，計算轉染率。用臺盼藍拒染試驗觀察各種條件下的不同轉染法的細胞存活率。
　　結果：改變不同的轉染條件后脂質體轉染的效率無明顯改變，平均轉染率低于2％，但對細胞的存活不產生明顯的影響;增加電穿孔的電壓后，轉染率在一定的電壓范圍內明顯上升，在電壓強度為250V時達到最高，平均轉染率為24.7％，但是細胞存活率相對較低;腺病毒感染法的平均轉導率在MOI值為250時達到高峰為52％，細胞的