綠僵菌新轉(zhuǎn)錄本及小泛素相關(guān)修飾基因功能的研究.pdf

1、綠僵菌在害蟲生物防治中起重要作用，也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蝗蟲等的防治。羅伯茨綠僵菌（Metarhizium robertsii，下稱綠僵菌）作為昆蟲病原真菌的模式生物，在昆蟲病原真菌的代謝調(diào)控，致病機(jī)理，遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制和生物技術(shù)防治研究中起重大作用。多年來，國內(nèi)外學(xué)者致力羅伯茨綠僵菌致病和抗逆的分子機(jī)理研究，取得了豐碩的結(jié)果;但是作為生防真菌，羅伯茨綠僵菌仍有很多的弱點(diǎn)，如:殺蟲速度較慢，易被環(huán)境影響等，因此，限制了綠僵菌在生產(chǎn)上的大規(guī)模應(yīng)用。

2、
　　轉(zhuǎn)錄組測序可以得到某一種特定組織或者細(xì)胞的將近全部轉(zhuǎn)錄本和基因序列通過利用二代測序平臺，而今，也已廣泛應(yīng)用于真核生物，包括綠僵菌，但羅伯茨綠僵菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究內(nèi)容較少;且通過利用RNA-Seq技術(shù)，可以解決特定的生物學(xué)問題，包括可變剪切分析，優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)，新轉(zhuǎn)錄本鑒定以及發(fā)掘新基因等。
　　為此，本研究以羅伯茨綠僵菌為研究對象，首先在4個不同條件下（包括生長發(fā)育、逆境脅迫、侵染定殖以及退化），培養(yǎng)綠僵菌，提取其總RNA

3、，并完成轉(zhuǎn)錄組測序;其次，就測序所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對預(yù)測的新轉(zhuǎn)錄本，完成功能注釋;最后，針對從注釋的新轉(zhuǎn)錄本中篩選到小泛素相關(guān)修飾基因(Small ubiquitin-related modifier,下稱SUMO)，進(jìn)行基因敲除，通過對敲除突變體和野生型菌株之間的生長表型、抗逆、產(chǎn)孢量和毒力的比較分析SUMO的可能生物學(xué)功能。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)新轉(zhuǎn)錄本:
　　研究共獲得80，9

4、54，892條序列(reads)，經(jīng)過質(zhì)量過濾，得到46，674，896clean reads，利用TopHat技術(shù)，比對到綠僵菌基因組，得到28，251，957reads。為了得到新轉(zhuǎn)錄本，便比對測序所組裝的轉(zhuǎn)錄本和參考基因組中已有的轉(zhuǎn)錄本。
　　本研究中，先對測序所組裝的轉(zhuǎn)錄本和參考基因組中已有的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對，再進(jìn)一步地預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本。結(jié)果發(fā)現(xiàn):共有769個新轉(zhuǎn)錄本，其中77個為可編碼的新轉(zhuǎn)錄本。利用NCBI本地BLAST以及

5、檢索得到的CDS(Coding sequence)數(shù)據(jù)，針對77個可編碼的新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋，最后篩選出NovelTr351號新轉(zhuǎn)錄本編碼SUMO蛋白;已經(jīng)有大量報道顯示:SUMO是與泛素化相類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種方式，SUMO不僅可以對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行負(fù)調(diào)控，也可以對其完成激活轉(zhuǎn)錄。這些或許正是對環(huán)境刺激產(chǎn)生的應(yīng)答反應(yīng)，由此可見小泛素相關(guān)修飾是一種多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，更是至關(guān)重要的。它不僅能降解無用的蛋白質(zhì)，而且參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控

6、，核轉(zhuǎn)運(yùn)和維持基因組完整性等細(xì)胞內(nèi)活動的修飾，使機(jī)體正常運(yùn)作，甚至避免某些疾病的發(fā)生。且有研究表明泛素途徑可以增強(qiáng)植物逆境生長能力。因此，本研究進(jìn)一步選擇SUMO對其可能的生物學(xué)功能進(jìn)行深入分析。
　　(2)SUMO的功能分析
　　通過基因敲除，本研究獲得了△SUMO（SUMO敲除突變株）以及cp△SUMO（△SUMO回補(bǔ)株）。隨后表型分析發(fā)現(xiàn):與野生型菌株和回補(bǔ)株相對比，敲除突變株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長速率和狀態(tài)以及對

7、化學(xué)物質(zhì)耐受和毒力，均無差異;但是敲除突變株孢子顏色由墨綠變淺;更進(jìn)一步的講，敲除突變株的產(chǎn)孢較為稀薄，且產(chǎn)孢量明顯低于野生型和回補(bǔ)菌株，下降了50％，這些結(jié)果表明SUMO基因?qū)G僵菌的產(chǎn)孢過程可能存在調(diào)控作用;此外，與野生型菌株和回補(bǔ)株相對比，敲除突變株對高溫和紫外的耐受力存在顯著差異:高溫45℃處理1h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除株較野生型和回補(bǔ)株的孢子萌發(fā)率下降35-45％;紫外100μJ/cm2照射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除株較野生型和回補(bǔ)株的孢子萌發(fā)率