綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢及相關基因分析.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。病原真菌主要以孢子侵染昆蟲，菌株的產(chǎn)孢能力是菌株選育時的重要參數(shù)。迄今為止，對于殺蟲真菌農藥生產(chǎn)直接相關的產(chǎn)孢機制的研究只有很少的報道。 包括綠僵菌在內的大多數(shù)的絲狀真菌是在由菌絲分化出來的分生孢子梗上形成分生孢子即正常產(chǎn)孢。本研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌(M.anisopliae)CQMa102在SYA固體培養(yǎng)基上可以進

2、行微循環(huán)產(chǎn)孢——孢子萌發(fā)后不經(jīng)過菌絲階段直接產(chǎn)孢。這種微循環(huán)產(chǎn)孢的特點是接種后孢子在培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量似酵母狀粘性孢子。 為了研究微循環(huán)產(chǎn)孢的分子機制，本研究以金龜子綠僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102為研究材料對微循環(huán)產(chǎn)孢進行了比較系統(tǒng)的研究。首先對綠僵菌CQMa102的微循環(huán)產(chǎn)孢培養(yǎng)基進行了篩選，確定了一種適合金龜子綠僵菌CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢的培養(yǎng)基。在此基礎上構建了綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢時期的均一化全長cDN

3、A文庫和富集微循環(huán)產(chǎn)孢相關基因的差減文庫，并對差減文庫進行了篩選。最后用生物信息學的方法對得到的ESTs(Expression Sequence Tag)進行了分析。 主要研究結果如下： ①利用數(shù)碼生物顯微鏡觀察CQMa102在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢過程。在SYA培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了微循環(huán)產(chǎn)孢現(xiàn)象。 ②對綠僵菌的這兩種不同的產(chǎn)孢方式進行比較，發(fā)現(xiàn)無論是在產(chǎn)孢總量還是產(chǎn)孢速度方面微循環(huán)產(chǎn)孢都優(yōu)于正常產(chǎn)孢。 ③采用DS

4、N(duplex-specific nuclease)均一化技術與SMARTm<'TM>(switchingmechanism at 5'end ofRNAtranscript)建庫技術相結合的方法，成功構建了綠僵菌菌株CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢時期的均一化全長cDNA文庫。 ④以微循環(huán)產(chǎn)孢時期的綠僵菌為實驗方(tester)以正常產(chǎn)孢時期的綠僵菌菌絲為驅動方(driver)，利用抑制消減雜交(suppression subtra

5、ctive hybridization，SSH)的方法構建了綠僵菌CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢時期的差減文庫。 ⑤對差減文庫中的1600個克隆進行了斑點雜交篩選和Reverse Northern dotblot篩選，得到400個陽性克隆，測序后得到340條質量較好的ESTs，代表285條非冗余ESTs。 ⑥在GenBank上用BLASTx對其進行序列同源性比對。結果表明109條ESTs編碼產(chǎn)物與己知蛋白質序列同源性較低或找不