喉癌MYCT1基因新轉(zhuǎn)錄本的克隆、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及功能研究.pdf

1、前言：
　　 喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)是僅次于肺癌的第二大上呼吸道惡性腫瘤,占喉部惡性腫瘤的近96%,在我國(guó)東北地區(qū)高發(fā),發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。喉癌的發(fā)生被認(rèn)為是多因素參與的過(guò)程,主要與吸煙、飲酒有關(guān)。雖然在疾病的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展,但在過(guò)去的幾十年里喉癌患者的生存率仍得不到改善,約為35-70%。因此,尋求喉癌新的診治標(biāo)志物無(wú)疑是一個(gè)重要課題。
　

2、　 盡管已有大量關(guān)于BCL2、c-Myc、EGFR等癌基因和P53、Rb、P16、P21等腫瘤抑制基因與喉癌相關(guān)性的報(bào)道,迄今為止除了Myctarget1(MYCT1),未見(jiàn)其他從喉癌組織中克隆相關(guān)基因的報(bào)道。
　　 MYCT1(GeneID:80177)是我課題組應(yīng)用電子雜交和分子生物學(xué)方法從喉癌組織中克隆得到的新的候選腫瘤抑制基因,曾命名MTLC(c-Myctarget from laryngeal cancer cell

3、s.Gen Bankaccession No.AF_527367)。該基因定位于6q25,全長(zhǎng)約21kb,含兩個(gè)外顯子,其mRNA序列長(zhǎng)約1006bp,編碼含235個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。雖然前期工作通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了該基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游47bp處,其5'旁側(cè)序列存在兩個(gè)c-Myc結(jié)合位點(diǎn),但均未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)?；虮磉_(dá)譜顯示MYCT1在人類(lèi)多種組織中均有表達(dá),已有報(bào)道證實(shí)該基因在胃癌、乳腺癌、肝癌中表達(dá)均下調(diào)。我們通過(guò)RACE

4、方法成功克隆得到一個(gè)MYCT1新的轉(zhuǎn)錄本MYCT1-TV,但其在喉癌等腫瘤組織中的表達(dá)情況及與MYCT1在結(jié)構(gòu)與功能上的差異尚不明確。
　　 本研究旨在確定MYCT1基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,對(duì)比研究?jī)蓚€(gè)轉(zhuǎn)錄本在喉癌中生物學(xué)功能和作用機(jī)制,為喉癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 材料與方法：
　　 以正常人外周血RNA為模板,應(yīng)用RACE方法確定MYCT1的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)、定點(diǎn)突變、EMS

5、A、ChIP和RNAi實(shí)驗(yàn),確定MYCT1的啟動(dòng)子區(qū)及與之結(jié)合的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。應(yīng)用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)喉癌組織和細(xì)胞中兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平。MTT、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)MYCT1-TV/MYCT1對(duì)Hep2和HEK293細(xì)胞增殖、凋亡以及體外侵襲能力等生物學(xué)特性的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、MYCT1基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的確定和cDNA的克隆
　　 應(yīng)用RACE實(shí)驗(yàn),成功克隆得到一長(zhǎng)110

6、6bp的MYCT1新的轉(zhuǎn)錄本,命名為MYCT1-TV,確定其轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游140bp處。
　　 2、MYCT1基因啟動(dòng)子區(qū)和特異性轉(zhuǎn)錄因子的確定
　　 熒光素酶、EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)確定MYCT1基因的啟動(dòng)子區(qū)為-852bp～+12bp,c-Myc通過(guò)與位于-852bp～-667bp區(qū)域的兩個(gè)E-box序列特異性結(jié)合調(diào)控MYCT1基因的啟動(dòng)子活性,此結(jié)果可被定點(diǎn)突變和RNA干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
　　

7、3、MYCT1-TV與MYCT1在喉癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)和生物學(xué)功能
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,MYCT1-TV與MYCT1在喉癌組織中mRNA的表達(dá)顯著低于癌旁對(duì)照組織;MYCT1-TV與MYCT1的過(guò)表達(dá)能抑制喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)喉癌細(xì)胞的凋亡、抑制喉癌細(xì)胞的侵襲能力,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯作用,提示其發(fā)揮腫瘤抑制基因功能。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功克隆得到長(zhǎng)1106br,的MYCT1新的轉(zhuǎn)錄本MYCT1-

8、TV,GenBank登錄號(hào)為GU997693;
　　 2、首次確定MYCT1-TV的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于ATG上游140bp處;
　　 3、確定MYCT1-TV的啟動(dòng)子區(qū)位于-852/+2bp,首次證實(shí)c-Myc能特異性結(jié)合于MYCT1-TV的啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4、MYCT1-TV與MYCT1可能均為MYCT1的主要存在形式,共同參與喉癌的發(fā)生發(fā)展,它們?cè)诤戆┲械牡捅磉_(dá)促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲,