金龜子綠僵菌MaECM33基因的克隆及分析.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，在昆蟲(chóng)防治中起著重要作用。近十多年來(lái)，在綠僵菌的致病機(jī)制、高毒力菌株選育和應(yīng)用技術(shù)等方面都取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，并實(shí)現(xiàn)了商品化。綠僵菌已成功的用于防治沙漠飛蝗、東亞飛蝗等多種蝗蟲(chóng)，已成為防治蝗蟲(chóng)的主要微生物農(nóng)藥，殺蝗綠僵菌1989年被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦為環(huán)保產(chǎn)品推廣應(yīng)用。作為一種觸殺性微生物殺蟲(chóng)劑，金龜子綠僵菌以孢子為殺蟲(chóng)單元侵染昆蟲(chóng)，但是由于

2、高溫、紫外線輻射、干燥等逆境對(duì)孢子的不利作用，殺蟲(chóng)真菌制劑在田間應(yīng)用中的防效受到明顯影響。而且在傳統(tǒng)的真菌殺蟲(chóng)劑研制中，菌株的選育注重于高毒力菌株的選育，忽略了產(chǎn)孢過(guò)程對(duì)商品制劑生產(chǎn)的影響和孢子特性對(duì)菌株毒力以及制劑貨架時(shí)間、田間時(shí)效性的影響。所以除了常規(guī)育種來(lái)選育高毒力菌株和分子生物學(xué)方法鑒定分離毒力相關(guān)基因之外，也應(yīng)該重視孢子特性和產(chǎn)孢相關(guān)基因的克隆和鑒定，從而闡明產(chǎn)孢及孢子特性等重要相關(guān)性狀形成的分子機(jī)制。這直接關(guān)系到縮短產(chǎn)孢時(shí)間

3、，提高產(chǎn)孢率，增強(qiáng)孢子耐儲(chǔ)藏性、抗逆境性等重要的劑型研制目標(biāo)，為選育產(chǎn)孢快、產(chǎn)孢率高、孢子特性優(yōu)良的工程菌株提供相應(yīng)的理論依據(jù)和目的基因，從而更好地實(shí)現(xiàn)綠僵菌作為生物殺蟲(chóng)劑的規(guī)?；瘧?yīng)用。
　　 目前，對(duì)于金龜子綠僵菌產(chǎn)孢的研究，主要是從環(huán)境因素和理化因子的角度來(lái)探索，而對(duì)于其孢子形成的分子機(jī)制的系統(tǒng)研究還少見(jiàn)報(bào)道。為了填補(bǔ)這個(gè)領(lǐng)域的空缺，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用消減雜交技術(shù)分別得到大量綠僵菌微循環(huán)產(chǎn)孢和正常產(chǎn)孢時(shí)產(chǎn)孢細(xì)胞形成過(guò)程中差異表

4、達(dá)的基因。
　　 本文選取其中一個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因，在PCR擴(kuò)增金龜子綠僵菌產(chǎn)孢時(shí)期均一化cDNA全長(zhǎng)文庫(kù)和篩選金龜子綠僵菌基因組文庫(kù)的基礎(chǔ)上，獲得了該基因的cDNA全長(zhǎng)序列和DNA序列，并命名為MaECM33。同時(shí)，構(gòu)建MaECM33基因的RNA干擾載體并轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌，以期利用RNA干擾的方法來(lái)研究該基因的功能。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果主要得出以下結(jié)論：
　　 1.克隆了金龜子綠僵菌ECM33基因的cDNA，序列全長(zhǎng)1396bp

5、含有一個(gè)1167bp的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼388個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。提交GenBank,登錄號(hào)為：FJ788387。命名為：MaECM33。
　　 2.根據(jù)MaECM33的cDNA序列推導(dǎo)出一個(gè)388個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，推導(dǎo)蛋白理論分子量為40443.0 Da，等電點(diǎn)為5.52。經(jīng)http://www.cbs.dtu.dk/預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)包括起始蛋氨酸在內(nèi)連續(xù)19個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽。通過(guò)Blast比對(duì)分析，表明該基因編碼產(chǎn)物

6、為一種糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphos phatidylinositol anchored protein，GPI-AP)。
　　 3.通過(guò)菌落原位雜交篩選金龜子綠僵菌基因組文庫(kù)，獲得MaECM33基因的DNA序列，將結(jié)構(gòu)基因序列與cDNA序列用bl2seq軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)基因含兩個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度分別為58bp和66bp，其中一個(gè)內(nèi)含子(969-1035)有典型的GT…AG邊界，而另一內(nèi)含子(73-130

7、)其邊界為TG…GG。
　　 4.Southern雜交表明，MaECM33以單拷貝的形式存在于綠僵菌基因組中。
　　 5.構(gòu)建了MaECM33基因的RNA干擾載體(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)，該干擾載體以質(zhì)粒pBTM為基本骨架，在該質(zhì)粒引入一個(gè)抗除草劑(ammonium glufosinate)的篩選標(biāo)記bar基因，在bar終止子的3'端順次插入來(lái)自于構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動(dòng)子和trpC啟動(dòng)子序列。在

8、兩個(gè)啟動(dòng)子之間是一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)，用于插入外源目的基因。
　　 6.用基因槍法成功地將MaECM33基因的RNA干擾載體(pbar-RNAi-gpd-trp-ECM33)轉(zhuǎn)化到金龜子綠僵菌中。相比其他轉(zhuǎn)化方法，基因槍法具有轉(zhuǎn)化受體操作迅速、簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。
　　 7.由于干擾載體具有抗除草劑的篩選標(biāo)記bar基因，將轉(zhuǎn)化后的綠僵菌孢子接種于含有除草劑的查氏培養(yǎng)基上，篩選得到一批轉(zhuǎn)化子，經(jīng)傳代培養(yǎng)