血清總IgE和特異性IgE魯米諾氧通道免疫分析方法的初步建立.pdf

1、目的:
　　由于過敏性疾病的發(fā)病率不斷升高，因此，建立有效的體外檢測手段對于過敏性疾病的預(yù)防和治療具有重要的意義。本研究主要是利用魯米諾氧通道免疫分析技術(shù)建立總IgE的定量檢測方法，并對所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià);在此基礎(chǔ)上，對該檢測體系進(jìn)行改進(jìn)，以中華絨螯蟹為例，采用魯米諾氧通道免疫分析技術(shù)建立血清特異性IgE的定量檢測方法，并對該反應(yīng)體系基質(zhì)、反應(yīng)條件及反應(yīng)模式進(jìn)行摸索優(yōu)化。
　　方法:
　　1.總IgE檢測方法的

2、建立:將受體微球包被鼠抗人IgE單克隆抗體，兔抗人IgE多克隆抗體標(biāo)記生物素，建立檢測總IgE的反應(yīng)體系，并對所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。
　　2.特異性IgE檢測方法的建立:提取中華絨螯蟹蛋白后標(biāo)記生物素，以中華絨螯蟹為例，建立檢測特異性IgE的方法，并對所建立方法的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)基質(zhì)等分析條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　3.分析測定臨床標(biāo)本未取得滿意結(jié)果原因:通過SDS-PAGE、斑點(diǎn)印跡等方法分別從生物素化蟹蛋白、受體微球等試劑方

3、面尋找未能成功檢測特異性IgE的原因。
　　結(jié)果:
　　1.總IgE方法學(xué)評價(jià):本研究所建立方法的批內(nèi)變異系數(shù)為3.33％-5.83％，批間變異系數(shù)為5.33％-9.40％;該方法的靈敏度為2.75IU/ml;回收率為98.11％-100.7％。通過檢測123例正常人血清總IgE值可知本實(shí)驗(yàn)建立方法的正常人參考值上限為225IU/ml;干擾性分析中，溶血、黃疸及脂血的干擾率均＜10％;用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測30份臨床標(biāo)本與B

4、eckman Coulter Immage800透射免疫比濁法的檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，r=0.962。
　　2.所提取的中華絨螯蟹蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可知，蟹蛋白粗提液中清晰可見的主要蛋白有10條，其相對分子量分別為98 kD、85 kD、77 kD、55kD、48 kD、45 kD、39kD、36kD、33 kD;提取的蟹蛋白能夠與收集的蟹過敏患者血清反應(yīng)，說明提取蟹蛋白具有免疫活性。
　　3.通過斑點(diǎn)印跡可

5、知，收集自醫(yī)院的陽性血清中含有特異性IgE;所提取蛋白經(jīng)生物素化處理后仍具有免疫活性，但通過SDS-PAGE分析可知，生物素化蟹蛋白僅能夠在85kD和77kD處看到明顯條帶。
　　結(jié)論:
　　1.本研究中所建立的方法能夠用于定量檢測血清總IgE水平，且具有靈敏度強(qiáng)，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，便于操作等優(yōu)點(diǎn)，適用于臨床使用。
　　2.采用丙酮抽提法所提取蛋白成分基本完整，且具有免疫活性，可作為已知抗原用于檢測特異性IgE。