青藤堿對糖尿病大鼠頸上交感神經節(jié)P2X2-3受體介導心臟自主神經病變中作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的主要特征之一就是血糖的升高,動物體體內的血糖的長時間保持在一個過高的狀態(tài),隨著對機體損害的增加毫無疑問將會造成機體組織的代謝紊亂。糖尿病會導致眾多并發(fā)癥,隨著每年糖尿病患者的增多,我們發(fā)現(xiàn)糖尿病心臟自主神經病變(Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN)已經成為糖尿病的眾多并發(fā)癥中最常見的之一,嚴重時可導致危及生命

2、的其它高危險性疾病如心肌梗死、心源性猝死等。三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)等存在于胞外的核苷酸特異識別P2受體,具有重要對神經信息進行傳遞的用途。P2受體分為配體門控型離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)。ATP及與它發(fā)生相互作用的P2X受體被認為參與頸上交感神經節(jié)的心交感信息的傳遞過程。本研究旨在了解青藤堿對高糖高脂條件下頸上交感神經節(jié)P2X2和P2X3受體介導病理生理作用的影響。
　　方法:

3、1、同源建模及分子對接實驗:同源建模構建 P2X2、P2X3(P2X2/3)受體的三維結構模型,通過分子對接方法篩選出與其對接自由能降低比較大的小分子藥物。2、動物實驗:采用2型糖尿病大鼠模型進行實驗,本實驗大鼠隨機分為:對照組(Ctrl)和糖尿病模型組(DM);第七周成功構建2型糖尿病大鼠模型后將糖尿病模型組(DM)隨機分為:糖尿病模型+生理鹽水對照組(DM+NS),糖尿病模型+青藤堿處理組(DM+SIN)(40 mg/kg),對照組

4、(Ctrl)用注射生理鹽水形成生理鹽水對照組(Ctrl+NS)。實驗內容:(1)在實驗過程中測量各組大鼠空腹血糖和餐后血糖的變化。(2)測量各組大鼠的心率、血壓及心率變異性指標。(3)免疫組化技術被用來直觀地檢測交感神經節(jié)P2X2受體和P2X3受體的表達情況,蛋白印跡等實驗方法可定量檢測實驗大鼠頸上交感神經節(jié)P2X2受體和P2X3受體的含量變化。(4)運用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法半定量觀察分析各組大鼠頸上交感神經節(jié)P2

5、X2受體和P2X3受體mRNA的含量變化。(5)進一步使用全細胞膜片鉗技術來研究青藤堿對頸上交感神經節(jié)神經元上的ATP激活電流的影響。
　　結果:1、同源建模及分子對接實驗結果:(1)同源建模獲得P2X2、P2X3的模型,通過Procheck檢驗90％以上的氨基酸位于允許區(qū)內,而且ATP結合口袋中的氨基酸殘基未出現(xiàn)在不允許區(qū)內;(2)通過分子對接篩選出青藤堿與P2X2、P2X3對接后體系的自由能降低較大,其絕對值接近受體與已知激動

6、劑結合的自由能變化,顯示青藤堿與P2X2、P2X3可能有很強的相互作用。2、動物實驗結果:(1)分析整理模型組大鼠的空腹血糖的數(shù)據(jù)表現(xiàn)出糖尿病的診斷標準,同時餐后血糖也發(fā)現(xiàn)和糖尿病診斷水平相當,同時測定的 Ctrl組大鼠的空腹血糖和餐后血糖經過比較分析認為處于正常范圍,表明2型糖尿病造模成功。給予青藤堿處理后,DM+SIN組的空腹血糖和餐后血糖顯著降低,與 DM+NS組相比有顯著性差異(p<0.01),但是該組數(shù)據(jù)進一步和Ctrl+NS

7、組比較發(fā)現(xiàn)其差異沒有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。(2)糖尿病模型大鼠心率加快、血壓升高,DM+SIN組的心率、血壓和糖尿病模型組相比更低(p<0.05),但是實驗數(shù)據(jù)進一步和Ctrl+NS組比較分析可以發(fā)現(xiàn)其差異沒有統(tǒng)計學意義(p>0.05)。糖尿病模型組大鼠血壓通過心率變異性分析獲得的低頻/高頻的數(shù)值( Low frequency/High frequency,LF/HF)都顯著得高于正常組(P<0.01),極低頻成分(Very lo

8、w frequency,VLF)、LF、HF和總的頻域值(Total Power,TP)則明顯低于正常組;DM+SIN組血壓與糖尿病模型組相比以上異常變化則得到明顯的改善(p<0.01)。(3)免疫組化和蛋白印跡結果表明,DM+NS組頸上交感神經節(jié)P2X2受體和 P2X3受體的表達較 Ctrl+NS組明顯升高,有統(tǒng)計學意義(p<0.01), DM+SIN和DM+NS組相比較表現(xiàn)出明顯的降低,有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。(4) RT-P