青藤堿對(duì)糖尿病大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X2-3受體介導(dǎo)心臟自主神經(jīng)病變中作用的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)的主要特征之一就是血糖的升高,動(dòng)物體體內(nèi)的血糖的長時(shí)間保持在一個(gè)過高的狀態(tài),隨著對(duì)機(jī)體損害的增加毫無疑問將會(huì)造成機(jī)體組織的代謝紊亂。糖尿病會(huì)導(dǎo)致眾多并發(fā)癥,隨著每年糖尿病患者的增多,我們發(fā)現(xiàn)糖尿病心臟自主神經(jīng)病變(Diabetic cardiac autonomic neuropathy,DCAN)已經(jīng)成為糖尿病的眾多并發(fā)癥中最常見的之一,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致危及生命

2、的其它高危險(xiǎn)性疾病如心肌梗死、心源性猝死等。三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)等存在于胞外的核苷酸特異識(shí)別P2受體,具有重要對(duì)神經(jīng)信息進(jìn)行傳遞的用途。P2受體分為配體門控型離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)。ATP及與它發(fā)生相互作用的P2X受體被認(rèn)為參與頸上交感神經(jīng)節(jié)的心交感信息的傳遞過程。本研究旨在了解青藤堿對(duì)高糖高脂條件下頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X2和P2X3受體介導(dǎo)病理生理作用的影響。
　　方法:

3、1、同源建模及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn):同源建模構(gòu)建 P2X2、P2X3(P2X2/3)受體的三維結(jié)構(gòu)模型,通過分子對(duì)接方法篩選出與其對(duì)接自由能降低比較大的小分子藥物。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn):采用2型糖尿病大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為:對(duì)照組(Ctrl)和糖尿病模型組(DM);第七周成功構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型后將糖尿病模型組(DM)隨機(jī)分為:糖尿病模型+生理鹽水對(duì)照組(DM+NS),糖尿病模型+青藤堿處理組(DM+SIN)(40 mg/kg),對(duì)照組

4、(Ctrl)用注射生理鹽水形成生理鹽水對(duì)照組(Ctrl+NS)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:(1)在實(shí)驗(yàn)過程中測(cè)量各組大鼠空腹血糖和餐后血糖的變化。(2)測(cè)量各組大鼠的心率、血壓及心率變異性指標(biāo)。(3)免疫組化技術(shù)被用來直觀地檢測(cè)交感神經(jīng)節(jié)P2X2受體和P2X3受體的表達(dá)情況,蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)方法可定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X2受體和P2X3受體的含量變化。(4)運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法半定量觀察分析各組大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)P2

5、X2受體和P2X3受體mRNA的含量變化。(5)進(jìn)一步使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來研究青藤堿對(duì)頸上交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元上的ATP激活電流的影響。
　　結(jié)果:1、同源建模及分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)同源建模獲得P2X2、P2X3的模型,通過Procheck檢驗(yàn)90％以上的氨基酸位于允許區(qū)內(nèi),而且ATP結(jié)合口袋中的氨基酸殘基未出現(xiàn)在不允許區(qū)內(nèi);(2)通過分子對(duì)接篩選出青藤堿與P2X2、P2X3對(duì)接后體系的自由能降低較大,其絕對(duì)值接近受體與已知激動(dòng)

6、劑結(jié)合的自由能變化,顯示青藤堿與P2X2、P2X3可能有很強(qiáng)的相互作用。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)分析整理模型組大鼠的空腹血糖的數(shù)據(jù)表現(xiàn)出糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)餐后血糖也發(fā)現(xiàn)和糖尿病診斷水平相當(dāng),同時(shí)測(cè)定的 Ctrl組大鼠的空腹血糖和餐后血糖經(jīng)過比較分析認(rèn)為處于正常范圍,表明2型糖尿病造模成功。給予青藤堿處理后,DM+SIN組的空腹血糖和餐后血糖顯著降低,與 DM+NS組相比有顯著性差異(p<0.01),但是該組數(shù)據(jù)進(jìn)一步和Ctrl+NS

7、組比較發(fā)現(xiàn)其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。(2)糖尿病模型大鼠心率加快、血壓升高,DM+SIN組的心率、血壓和糖尿病模型組相比更低(p<0.05),但是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步和Ctrl+NS組比較分析可以發(fā)現(xiàn)其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。糖尿病模型組大鼠血壓通過心率變異性分析獲得的低頻/高頻的數(shù)值( Low frequency/High frequency,LF/HF)都顯著得高于正常組(P<0.01),極低頻成分(Very lo

8、w frequency,VLF)、LF、HF和總的頻域值(Total Power,TP)則明顯低于正常組;DM+SIN組血壓與糖尿病模型組相比以上異常變化則得到明顯的改善(p<0.01)。(3)免疫組化和蛋白印跡結(jié)果表明,DM+NS組頸上交感神經(jīng)節(jié)P2X2受體和 P2X3受體的表達(dá)較 Ctrl+NS組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01), DM+SIN和DM+NS組相比較表現(xiàn)出明顯的降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。(4) RT-P