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文檔簡介
1、目的:
建立兔頸上交感神經(jīng)節(jié)(superior cervical sympathetic ganglion,SCSG)損毀模型,用誘導分化的骨髓源神經(jīng)干細胞(Neuron stem cells,NSC)對其移植,觀察兔瞳孔恢復情況,檢測受損SCSG內(nèi)微管相關蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFA
2、P)的變化,探討神經(jīng)干細胞對神經(jīng)損傷的修復作用及可能途徑。
方法:
取新生1周新西蘭白兔股骨骨髓,經(jīng)全骨髓密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法得到兔骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived stroma cells,BMSCs),用堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)定向
3、誘導為神經(jīng)干細胞,并分別鑒定BMSCs及神經(jīng)干細胞的表型特征。
用直持針鉗壓榨兔SCSG、每次壓榨10s,制備兔SCSG損毀模型(24只),造模成功后隨機分為三組(每組8只):模型對照組(B組),培養(yǎng)液對照組(C組),神經(jīng)干細胞干預組(D組)。A組為正常組(8只),不進行造模。
SCSG損毀模型成功后第7天,B組用注射器經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射1ml生理鹽水,C組注射1ml神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液,D組注射1ml含2×106個神經(jīng)
4、干細胞的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液。分別于移植后第1天、第7天、第10天、第14天、第21天觀察記錄四組兔損傷側(cè)瞳孔直徑變化;移植第21天后處死兔,取損毀側(cè)兔SCSG,免疫組化檢測其MAP-2、GFAP的變化情況。
結(jié)果:
1:兔SCSG損毀后,損毀側(cè)表現(xiàn)出Horner綜合征:瞳孔縮小,瞼裂變小,眼球凹陷;造模后28天Horner綜合征表現(xiàn)仍較突出。
2:分離培養(yǎng)的兔BMSCs,免疫細胞化學檢測結(jié)果提示CD44、CD
5、54呈陽性表達,CD34呈陰性表達,符合BMSCs的表型特征;誘導后的神經(jīng)干細胞,NSE、Nestin免疫細胞化學檢測結(jié)果均呈陽性表達,符合神經(jīng)干細胞的表型特征。
3:瞳孔直徑測量(mm),移植后第1、7、10、14、21,A組右側(cè)瞳孔分別為:7.92+0.38,8.02+0.30,8.13+0.37,7.96+0.36,8.12+0.25;B組:5.82+0.42,5.84+0.34,5.68+0.29,5.91+0.31,
6、5.80+0.36;C組:5.85+0.32,5.75+0.32,5.64+0.37,5.84+0.27,5.59+0.23;D組:5.64+0.33,5.72+0.35,6.79+0.33,7.98+0.28,8.06+0.21;B組與C組各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但均低于A組, D組與A組比較,在第1、7、10天差異有統(tǒng)計學意義,在第14、21天無統(tǒng)計學意義,D組分別與B組、C組比較,在第1、7天差異無統(tǒng)計學意義
7、,在第10、14、21天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組內(nèi)的比較:A、B、C組各時間點比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);D組組內(nèi)第7天與第1天差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);第10天與第1、7天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第14天與第1、7、10天比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第21天與第1、7、10天比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與第14天比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
4:病理組織觀察結(jié)
8、果:
?。?)HE染色:B組與C組SCSG內(nèi),神經(jīng)元細胞稀少,細胞排列不均勻,細胞形態(tài)、大小各異,細胞間質(zhì)增生較多,血管形成較少,細胞核出現(xiàn)固縮,并可見炎性細胞浸潤;A、D組兔SCSG內(nèi),細胞生長更緊密、排列更整齊,細胞形態(tài)及大小大體一致,有少量細胞間質(zhì)增生,血管形成更豐富,細胞核無固縮現(xiàn)象。
?。?)MAP-2:B組與C組神經(jīng)節(jié)MAP-2呈陰性表達,A組與D組MAP-2呈陽性表達,光密度測量:A組0.787+0.245
9、,B組0.457+0.022,C組0.447+0.020,D組0.771+0.027;B組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),A組D組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), A、D組分別與B組、C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
?。?)GFAP:B組與C組GFAP呈陽性表達,A組與D組GFAP呈陰性表達,光密度值測量:A組0.249+0.020,B組0.640+0.038,C組0.658+0.031,D組0.2
10、71+0.022;B組與C組比較差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P>0.05),A組與D組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而A組與D組明顯低于B組與C組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結(jié)論:
1、兔SCSG損毀后體內(nèi)神經(jīng)元的標志蛋白MAP-2下降、膠質(zhì)細胞的標志蛋白GFAP增加。
2、神經(jīng)干細胞移植對受損的兔SCSG神經(jīng)功能有修復作用,其作用途徑可能是通過抑制GFAP的表達、促進MAP-2的表達來實
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