激活突變酪氨酸磷酸酶SHP-2參與髓系增殖性疾病的機制探討.pdf

1、目的：通過研究證實激活突變的酪氨酸磷酸酶SHP-2（PTPN11）是否參與髓系增殖性疾病的發(fā)生，以及初步探討SHP-2參與髓系增殖性疾病可能的分子機制。
　　 方法：首先檢測比較野生型(Wild type,WT)、SHP-2 突變型(SHP-2 D61G/+)小鼠外周血白細胞數(shù)的變化，及其隨周齡的增長變化關系（即用8 周齡和16 周齡的外周血白細胞做結果對比）；比較脾臟大小，運用16周齡WT組與SHP-2 D61G/+突變組脾臟

2、做結果比較，并分別取8w、16w 小鼠的脾臟計算SI （spleen index=spleen weight （mg）/mouse weight）值以確定脾臟的相對增大程度。應用流式細胞儀（Flow Cytometry,FCM）技術分別測定WT 組、SHP-2 D61G/+突變組小鼠外周血白細胞表面標志分子（Mac-1、Gr-1）、并統(tǒng)計Mac-1的陽性細胞率及骨髓細胞中Ter119 (紅系)、Mac-1和Gr-1 (髓系)、CD3 (

3、T 淋巴細胞系)、B220 (B 淋巴細胞系)的陽性細胞率。同時對兩組髓系細胞運用細胞集落形成實驗(Cell Colony forming Units，CFU)分析髓系細胞集落形成能力及通過計數(shù)觀察細胞增殖情況的差異。分離培養(yǎng)髓系細胞獲得肥大細胞，MTS 法檢測肥大細胞在IL3(白介素-3 或稱多集落刺激因子multi-F）誘導下的細胞增殖性差異。SDS-PAGE和Western blot 檢測肥大細胞中Erk、Art在IL3 誘導下的

4、磷酸化水平與表達情況。 Western blot和IP 檢測IL3 刺激下肥大細胞中SHP-2與Gab-2(Grb2 相關結合蛋白2)的結合情況。
　　 結果：SHP-2 D61G/+突變組小鼠較WT 組外周血白細胞數(shù)明顯升高（P<0.05）、小鼠的脾臟也明顯增大，8 周齡、16 周齡SHP-2 D61G/+突變組小鼠測得的SI 值也較WT 組明顯升高；流式結果顯示16 周齡SHP-2 D61G/+突變組的外周血白細胞的Mac-

5、1、Gr-1增多，Mac-1 陽性細胞率增加，骨髓髓系細胞中Mac-1、Gr-1的陽性細胞率也增多，但紅系、淋巴細胞系的變化不明顯。對兩組小鼠髓系細胞用IL3 誘導后，SHP-2 D61G/+組比WT 組的髓系細胞集落形成能力增強、肥大細胞中Erk和Akt的磷酸化水平明顯升高；SHP-2 D61G/+雜合突變后與Gab-2 結合能力增高。提示SHP-2 D61G/+突變導致髓系細胞發(fā)生增殖、重要信號分子Erk、Art的磷酸化水平提高以及