蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2調(diào)控巨噬細(xì)胞活化與肺泡微環(huán)境穩(wěn)態(tài)研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是一群具有高度可塑性的固有免疫細(xì)胞，其會(huì)隨著微環(huán)境的不同改變相應(yīng)的改變功能表型并且也會(huì)通過分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等參與微環(huán)境結(jié)構(gòu)的塑造。
　　Shp2結(jié)構(gòu)上是由兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PTP結(jié)構(gòu)域組成的非受體型酪氨酸磷酸酶。之前的研究表明，其作為關(guān)鍵的信號(hào)分子調(diào)控病理與生理過程。我們的部分研究表明Shp2在肺泡微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面起到非常重要的作用。而作為肺泡微環(huán)境中最重要組成部分和最主要的固有免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的活化及其效應(yīng)分子的表

2、達(dá)調(diào)控上并不清楚。同時(shí)Shp2如何調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能也不是很清楚。因此我們利用條件性巨噬細(xì)胞Shp2敲除的基因修飾小鼠模型，離體和體內(nèi)水平上探究這一調(diào)控過程及可能的干預(yù)手段。
　　關(guān)于巨噬細(xì)胞的活化一般意義上被分為兩種:經(jīng)典活化（M1活化）和替代活化（M2活化）。在Th1型細(xì)胞因子IFNγ/LPS刺激下巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1活化類型;而在Th2型細(xì)胞因子IL-4或IL-13刺激下巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M2型活化。M2活化的巨噬細(xì)胞參與寄生蟲感染的

3、防護(hù)，損傷修復(fù)等病理及病理生理過程，而非正常的M2型活化將正常的生理過程轉(zhuǎn)變?yōu)椴±磉^程。因此控制巨噬細(xì)胞的M2型活化非常關(guān)鍵，但目前對(duì)巨噬細(xì)胞M2型活化的機(jī)理還不是很清楚，并且其與疾病相關(guān)的體內(nèi)及動(dòng)物模型方面的研究也不是很透徹。
　　肺泡微環(huán)境中由巨噬細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶是巨噬細(xì)胞參與微環(huán)境塑造的最重要的效應(yīng)分子。有研究表明過度的巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶(MMP12)的表達(dá)破壞細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)并造成肺氣腫的病理過程。然而，這類基質(zhì)金

4、屬蛋白酶的體內(nèi)調(diào)控研究也還不是很清楚。
　　1.主要研究方法和材料
　　1.1實(shí)驗(yàn)小鼠和細(xì)胞培養(yǎng)
　　我們將帶有LysM-Cre啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因小鼠與Shp2flox/flox小鼠雜交獲取巨噬細(xì)胞條件性Shp2缺失的動(dòng)物模型，用于原代細(xì)胞的獲取、體內(nèi)模型及病理模型的評(píng)估等。
　　體外研究的細(xì)胞系選取RAW264.7巨噬細(xì)胞系。通過骨髓誘導(dǎo)得到BMDM(Bone marrow derived macrophage)離

5、體誘導(dǎo)細(xì)胞。通過BALF和腹水純化分別得到肺泡和腹腔原代細(xì)胞用于后續(xù)研究。
　　1.2體外M2活化的誘導(dǎo)和評(píng)估，MMP12的表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
　　采用不同濃度梯度及不同時(shí)間梯度的IL-4刺激原代及巨噬細(xì)胞系。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，Western Blotting，激光共聚焦顯微鏡，化學(xué)發(fā)光等手段檢測(cè)M2活化巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物或MMP12等的表達(dá)，蛋白水平和酶活等。
　　通過對(duì)各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白活化的蛋白水平上的評(píng)估等探

6、索可能的調(diào)控機(jī)理。
　　1.3動(dòng)物模型
　　文中主要采用的動(dòng)物模型為通過幾丁質(zhì)(Chitin)腹腔注射誘導(dǎo)體內(nèi)巨噬細(xì)胞M2活化的模型，進(jìn)一步在體內(nèi)證實(shí)Shp2的缺失對(duì)巨噬細(xì)胞M2活化的影響。
　　通過血吸蟲模型評(píng)估巨噬細(xì)胞體內(nèi)M2活化和肺纖維化病理表型。
　　通過Bleomycin(BLM)氣管給藥，誘導(dǎo)肺纖維化的病理模型，評(píng)估Shp2調(diào)控巨噬細(xì)胞活化對(duì)纖維化病理過程的影響。
　　通過自然衰老模型，研究衰老

7、相關(guān)的漸進(jìn)性肺氣腫表型，評(píng)估巨噬細(xì)胞Shp2可能造成的基質(zhì)金屬蛋白酶穩(wěn)態(tài)破壞而造成的肺氣腫病理過程。
　　2.主要研究結(jié)果
　　2.1Shp2作為新的控制巨噬細(xì)胞M2活化的重要的負(fù)向調(diào)控因子;
　　2.2 Shp2在IL-4所介導(dǎo)的JAK1/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用;
　　2.3 Shp2的缺失將促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2活化水平進(jìn)而加速BLM-誘導(dǎo)的肺纖維化病理進(jìn)程。
　　2.4肺泡巨噬細(xì)胞缺失了磷酸酶S

8、hp2會(huì)過度表達(dá)MMP12;
　　2.5小鼠肺泡巨噬細(xì)胞Shp2缺失會(huì)自發(fā)產(chǎn)生年齡相關(guān)的進(jìn)行性肺氣腫;
　　2.6 Shp2通過正向調(diào)控TGFβ1信號(hào)抑制MMP12的過度表達(dá)。
　　3.結(jié)論
　　Shp2是在巨噬細(xì)胞M2活化的新的關(guān)鍵的負(fù)向信號(hào)調(diào)控分子;巨噬細(xì)胞中Shp2蛋白水平的下調(diào)或缺失將促進(jìn)M2相關(guān)的纖維化病理進(jìn)程。另一方面Shp2通過正向調(diào)控TGF1的信號(hào)通路維持肺泡微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，肺泡巨噬細(xì)胞特異的Shp