酪氨酸磷酸酸SHP-2在腎纖維化中的作用及其免疫學(xué)機制.pdf

1、梗阻性腎病，簡言之就是指尿路梗阻引起的腎功能上或解剖上的損害，是泌尿外科的常見病多發(fā)病。梗阻性腎病的發(fā)病機理涉及多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要包括腎小球纖維化、腎小管性纖維化及上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)三種發(fā)病模式。目前，腎小管性纖維化和EMT致纖維化作用愈來愈受到重視。在腎小管性纖維化和EMT模式中，Toll樣受體(TLRs)在巨噬細(xì)胞生物學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和促炎性細(xì)胞因子的釋放過程中的作用尤為突出。TLRs家族是重要的模式識別受體(PRR)，屬

2、Ⅰ型跨膜受體，結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)、跨膜部分和胞質(zhì)區(qū)。TLRs分布廣泛，主要分布于許多免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，腎小管上皮細(xì)胞(TEC)和腎系膜細(xì)胞中也有分布。病原微生物保守的抗原分子即病原體相關(guān)分子模式(PAMPS)能夠被TLR特異性的識別，從而激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和激活免疫反應(yīng)，如TLR4識別細(xì)菌脂多糖(LPS)，而TLR3識別病毒的雙鏈RNA。此外，Toll受體還能識別內(nèi)源性配體，包括熱休克蛋白(HS

3、P)，細(xì)胞外基質(zhì)成分等。腎纖維化過程中也有大量內(nèi)源性配體被釋放，緊接著TLRs受體的下游信號通路被活化后生成了大量的促炎性細(xì)胞因子，參與了腎臟纖維化的天然免疫反應(yīng)并發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 SHP-2是一種蛋白酪氨酸磷酸酶，在各種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，SHP-2在許多方面參與調(diào)控體內(nèi)造血細(xì)胞功能，抑制信號級聯(lián)反應(yīng)，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)信號級聯(lián)反應(yīng)的削弱和終止。前期研究發(fā)現(xiàn)SHP-2可以抑制外源性TLRs配體啟動的活化信號如細(xì)菌

4、脂多糖(LPS)、聚肌胞苷酸(poly I:C)等，并且SHP-2還可以抑制poly I:C誘導(dǎo)的MAPK通路的激活。此外，TRIF是TLR-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要調(diào)節(jié)蛋白，有關(guān)TRIF在TLR-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，SHP-2通過與TRIF信號通路中的TBK-1蛋白競爭性結(jié)合抑制TRIF通路的活化，從而抑制下游促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。在復(fù)雜的體內(nèi)免疫反應(yīng)過程中，SHP-2所介導(dǎo)的負(fù)向調(diào)控引起的細(xì)胞因子表達(dá)譜的改變將會產(chǎn)生何種結(jié)果？SHP-2的這種對于

5、TLR信號通路的負(fù)向調(diào)控在梗阻性腎病腎纖維化的病理生理背景下是否具有臨床意義？
　　 鑒于目前尚無見SHP-2在腎纖維化病理生理反應(yīng)中的調(diào)控作用，我們在本課題中首先繁育了巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺陷的小鼠，研究觀察通過外源性配體活化其巨噬細(xì)胞TLR后促炎性因子的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了SHP-2質(zhì)粒，通過上調(diào)SHP-2表達(dá)進一步驗證了SHP-2抑制巨噬細(xì)胞活化釋放的炎性因子。最后，我們研究了體內(nèi)實驗中SHP-2對梗阻性腎病

6、后腎纖維化炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機制。
　　 一、巨噬細(xì)胞SHP-2條件性缺陷小鼠的繁育及穩(wěn)定傳代
　　 前期有人利用RNA干擾技術(shù)將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中SHP-2基因沉默達(dá)70％以上，然后用poly(I:C)和LPS分別刺激巨噬細(xì)胞TLR3/TLR4從而促進炎性細(xì)胞因子的釋放，結(jié)果顯示SHP-2的沉默導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)TRIF在TLR-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，SHP-2抑制巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子的表達(dá)是通過其與T

7、RIF信號通路中的TBK-1蛋白相結(jié)合而實現(xiàn)。我們以巨噬細(xì)胞中SHP-2為研究突破點，采用Cre-loxP系統(tǒng)，需要涉及flox突變體小鼠的交配和Cre表達(dá)小鼠路線，一旦Cre表達(dá)的特異性已經(jīng)證實，Cre轉(zhuǎn)基因就能和floxed（兩個loxP位點）的小鼠雜交生出條件性敲除性小鼠。我們繁育的小鼠正是在SHP-2基因外顯子兩個位點加上loxP，且表達(dá)Cre后條件性敲除了SHP-2基因，最終成功繁育出巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺陷的小鼠并已

8、經(jīng)穩(wěn)定傳代繁殖，為后期建立小鼠UUO動物模型奠定實驗基礎(chǔ)，深入了解SHP-2負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞TLR-4信號干預(yù)慢性腎纖維化中的效果與機制，為設(shè)計干預(yù)腎纖維化進程的靶點提供實驗依據(jù)。
　　 二、過表達(dá)SHP-2抑制巨噬細(xì)胞釋放的促炎性細(xì)胞因子表達(dá)
　　 在本部分研究中，我們首先抽取巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺失小鼠和同窩對照組小鼠的巨噬細(xì)胞，利用Toll樣受體4(TLR4)識別的配體，如細(xì)菌脂多糖(LPS)，刺激后觀察巨

9、噬細(xì)胞釋放的炎性因子表達(dá)的差異，結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞SHP-2缺陷小鼠的促炎性細(xì)胞因子如TNF-a、IL-1β、TGF-β1的表達(dá)較同窩對照組顯著升高，后期我們采用pcDNATM3.1體系構(gòu)建SHP-2質(zhì)粒和空質(zhì)粒，并且用SHP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染野生型小鼠的巨噬細(xì)胞后使SHP-2過表達(dá)，同時用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為對照組，轉(zhuǎn)染48小時后用LPS刺激，結(jié)果顯示SHP-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞SHP-2的表達(dá)較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)顯著升高，而巨噬細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因

10、子如TNF-a、IL-1β、TGF-β1等表達(dá)較空質(zhì)粒對照組表達(dá)顯著降低。由此從另一方面證實了SHP-2減輕了LPS引起的炎癥反應(yīng)，進一步說明SHP-2可以負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞TLR-4從而降低炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，為小鼠單側(cè)輸尿管梗阻致腎纖維化的體內(nèi)實驗提供一定的理論依據(jù)。
　　 三、SHP-2對腎纖維化的影響及其調(diào)控機制研究
　　 在本部分實驗中，我們采用了巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺陷小鼠和同窩對照小鼠同時行單側(cè)輸尿管

11、結(jié)扎術(shù)來研究SHP-2對腎纖維化的影響。實驗結(jié)果顯示腎組織病理切片顯示巨噬細(xì)胞SHP-2缺陷小鼠總膠原纖維含量、腎小管凋亡程度、壞死區(qū)域范圍、病理評分顯著高于同窩對照組小鼠，western blot結(jié)果顯示凋亡信號分子活性表達(dá)顯著高于同窩對照組，而腎功能指標(biāo)（血肌酐和尿素氮）無明顯差異。隨后，我們研究了巨噬細(xì)胞SHP-2缺陷之后的這種損傷加重與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，免疫組化結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺陷的小鼠在UUO術(shù)后的腎間質(zhì)中

12、大量巨噬細(xì)胞浸潤，數(shù)量明顯多于同窩對照組，另外qPCR檢測也提示巨噬細(xì)胞SHP-2缺陷小鼠的腎臟巨噬細(xì)胞釋放的促炎性細(xì)胞因子表達(dá)顯著升高，這些促炎性細(xì)胞因子都是TLR信號通路的下游產(chǎn)物，這就為巨噬細(xì)胞SHP-2基因條件性缺陷小鼠偏重的病理損傷提供了解釋。本部分研究證實了巨噬細(xì)胞SHP-2條件性缺陷后腎纖維化程度顯著加劇，這種加劇的損傷主要是炎癥反應(yīng)引起的，而TLR信號的過度活化可能是造成炎癥反應(yīng)過重的主要原因。
　　 綜合上述三