重組人凋亡素2配體Ⅰ期臨床及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、凋亡素2配體(Apo-2 ligand，Apo2L)，或稱(chēng)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAlL)，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族新成員，它通過(guò)與細(xì)胞表面相應(yīng)的死亡受體相結(jié)合，啟動(dòng)凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)，能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常組織無(wú)明顯損傷，因而成為目前細(xì)胞凋亡領(lǐng)域抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)?；贏po2L／TRAlL獨(dú)特的作用

2、機(jī)制、重組人可溶性Apo2L／TRAlL臨床前體現(xiàn)出的廣譜的抗腫瘤作用和良好的安全性、以及內(nèi)源性血管生成抑制因子抗腫瘤研究進(jìn)展，本課題開(kāi)展了下述兩方面的研究：①?lài)?guó)產(chǎn)重組人凋亡素2配體(rh-Apo2L)的Ⅰ期臨床研究；②人Apo2L／TRAlL與人血管生成抑制因子融合表達(dá)的基礎(chǔ)研究。 第一部分：重組人凋亡素2配體(rh-Apo2L)的Ⅰ期臨床研究 目的：觀察晚期惡性腫瘤病人對(duì)rh-Apo2L靜脈滴注后的耐受性；測(cè)定該藥在

3、人體的藥代動(dòng)力學(xué)主要參數(shù)；初步觀察其抗腫瘤療效；提出Ⅱ期臨床研究合理的劑量及方案。方法：符合招募標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書(shū)的晚期惡性腫瘤志愿者，首先接受rh-Apo2L皮試，皮試陰性者才能接受rh-Apo2L治療：按“3+3”原則進(jìn)行劑量爬坡，每組3～6例。研究方案為，rh-Apo2L溶于250毫升0.9％生理鹽水中，靜脈滴注2小時(shí)，每天一次，連用14天(d)，觀察14天，28天為一周期。根據(jù)耐受性研究結(jié)果，選擇患者取血清采用“Sandwic

4、h ELISA”方法，進(jìn)行單次或連續(xù)給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果：入組患者22例，2例皮試陽(yáng)性退出研究，20例完成劑量爬坡和耐受性研究。rh-Apo2L給藥由10μg／kg／d爬坡至300μg／kg／d共6個(gè)劑量組，具體為10μg／kg／d、30μg／kg／d、100μg／kg／d、150μg／kg/d、200μg／kg／d、300μg／kg／d。 耐受性研究顯示，rh-Apo2L，的毒性反應(yīng)輕微。除300μg／kg／d劑量組出現(xiàn)

5、度全身炎性反應(yīng)綜合征，其余均為Ⅰ～Ⅱ度不良反應(yīng)，包括發(fā)熱、疲勞、乏力、皮膚粘膜改變、消化道反應(yīng)、心血管系統(tǒng)毒性、骨髓抑制和肝腎功能損傷。所有毒副反應(yīng)均在停藥2周內(nèi)恢復(fù)。未出現(xiàn)過(guò)敏性休克和藥物相關(guān)死亡。19例可評(píng)價(jià)療效，13例(68％)為穩(wěn)定，6例(32％)為進(jìn)展。四個(gè)劑量水平(30μg／kg／d、100μg／kg／d、150pg／kg／d、200μg／kg／d)共18例次患者，進(jìn)行了單次或連續(xù)給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)論：rh-Apo2L

6、靜脈滴注后的耐受性良好，劑量限制性毒性(DLT)是全身炎性反應(yīng)綜合征；最大耐受劑量(MTD)為200μg／kg／d；rh-Apo2L靜脈滴注符合二室模型藥動(dòng)學(xué)分布特性和線性動(dòng)力學(xué)特征。Ⅱ期臨床研究推薦方案為150μg／kg／dx14d(該劑量水平已超過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出的有效劑量)，28天為一周期。 第二部分：人Apo2L／TRAIL與人血管生成抑制因子融合表達(dá)的研究 目的：將不同來(lái)源的內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子——人凝血系統(tǒng)

7、分子kininogen來(lái)源的片斷kininostatin、人細(xì)胞內(nèi)蛋白caketiculin來(lái)源的片斷vasostatin及人Ⅳ型膠原α2鏈C末端來(lái)源的canstatin，分別與人Apo2L／TRAIL進(jìn)行融合表達(dá)，通過(guò)初步生物學(xué)活性觀察，從中篩選出雙功能蛋白——即特異地抑制腫瘤組織新生血管形成和殺傷腫瘤細(xì)胞的分子。方法：實(shí)驗(yàn)根據(jù)內(nèi)源性血管生長(zhǎng)抑制因子kininostatin、vasostatin、canstatin與Apo2L／TRA

8、IL的編碼序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物；分別以包含這些分子的編碼序列的質(zhì)粒為模板，用兩輪聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(即SOEing法)擴(kuò)增出通過(guò)氨基酸連接臂(Linker，氨基酸序列為GGGSGGSG)連接的編碼融合蛋白的DNA序列；相應(yīng)的融合基因插入原核表達(dá)載體pBV220中，得到各融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選出含重組質(zhì)粒的克隆，42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)，獲得一系列融合蛋白：A-K(Apo2L-Kininostatin)

9、，K-A(Kininostatin-Apo2L)，A-V(Ap02L-Vasostatin)，V-A(Vasostatin-Apo2L)，A-C(Apo2L-Canstatin)，C-A(Canstatin-Apo2L)；分析、鑒定和純化所表達(dá)的重組融合蛋白后，通過(guò)腫瘤細(xì)胞株SW1990和NCI-H460的殺傷實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖抑制實(shí)驗(yàn)、以及ECV304細(xì)胞管腔形成抑制實(shí)驗(yàn)，分析融合蛋白的生物學(xué)活性，以篩選出具有最強(qiáng)抗腫瘤作

10、用的雙功能的分子。結(jié)果：6種融合蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中都得到了表達(dá)；K-A(Kininostatin-Apo2L)和V-A(Vasostatin-Apo2L)融合蛋白基本保持著Apo2L／TRAIL殺傷腫瘤細(xì)胞的活性；融合蛋白也增強(qiáng)了Apo2L／TRAIL對(duì)ECV304的殺傷作用，從而確定了融合蛋白中血管生長(zhǎng)抑制因子的生物學(xué)活性；通過(guò)管腔形成實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了K-A、V-A的新生血管生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)論：本部分工作，在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效重組表達(dá)了