白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-2在TLR介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功能研究.pdf

1、目的:
　　白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-2(IRAK2)是Toll樣受體(TLR)介導(dǎo)的信號(hào)通路中重要的蛋白激酶和調(diào)節(jié)分子,但其功能和作用機(jī)理還不完全清楚。本研究利用IRAK2基因敲除小鼠和同背景野生型小鼠,探討IRAK2在TLR4和TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功能及對(duì)前炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)機(jī)制。首先闡明IRAK2對(duì)內(nèi)毒素所致膿毒性休克的作用,進(jìn)而將小鼠骨髓干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞(BMMs),研究IRAK2在TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功

2、能及其對(duì)前炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)機(jī)制;鑒定IRAK2的激酶活性并研究其在TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功能和調(diào)節(jié)前炎癥細(xì)胞因子的機(jī)制。在TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路中,利用胞漿樣樹(shù)突狀細(xì)胞,研究IRAK2在DNA病毒感染和CpG誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子及干擾素中的作用;并利用BMMs,研究IRAK2對(duì)TLR9介導(dǎo)基因表達(dá)普及NF-κB活化的影響,進(jìn)一步闡明IRAK2在TLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功能。由于IRAK2在TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和機(jī)體自身修復(fù)中發(fā)

3、揮關(guān)鍵作用,對(duì)IRAK2調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)機(jī)制的闡明,有望為炎癥治療開(kāi)辟新的途徑;同時(shí),作為重要的蛋白激酶,IRAK2本身亦可能成為一個(gè)很有潛力的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　將LPS按20mg/kg注射到野生型和同背景IRAK2基因敲除小鼠腹腔,比較野生型和IRAK2基因缺失小鼠對(duì)LPS引起的膿毒性休克而導(dǎo)致死亡率的差別,并檢測(cè)注射LPS的小鼠(4mg/kg)血清中前炎癥細(xì)胞因子IL1β、IL6、TNFα的濃度,以評(píng)價(jià) IRAK2

4、在內(nèi)毒素所致膿毒性休克中的作用;將小鼠骨髓干細(xì)胞在體外分化為巨噬細(xì)胞(BMMs),采用 ELISA技術(shù)檢測(cè) LPS和R848誘導(dǎo)的BMMs培養(yǎng)上清中Il6、KC和TNFα的濃度,初步確定IRAK2在TLR4和TLT7介導(dǎo)的信號(hào)通路中的功能;進(jìn)一步采用Realtime PCR,檢測(cè)IRAK2在TLR4介導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子mRNA穩(wěn)定性中發(fā)揮的作用;并用多聚核糖體分離技術(shù)將LPS誘導(dǎo)表達(dá)的mRNA分為具有翻譯活性和沒(méi)有翻譯活性的兩相,結(jié)合R

5、ealtime PCR分別檢測(cè)兩相中mRNA的量,以評(píng)估IRAK2對(duì)TLR4介導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子mRNA翻譯水平的調(diào)節(jié)作用;然后構(gòu)建野生型 IRAK2(IRAK2-WT)及IRAK2的ATP結(jié)合位點(diǎn)突變體(IRAK2-KD)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng),包裝病毒后感染IRAK2基因敲除的BMMs,使外源IRAK2高表達(dá)以重建其功能,并采用該細(xì)胞模型來(lái)鑒定 IRAK2的激酶活性和研究其激酶活性與下游底物活化之間的關(guān)系,探討IRAK2激酶活性在TL

6、R4信號(hào)通路中對(duì)前炎性因子的調(diào)節(jié)作用。
　　利用鼠皰疹病毒68(MHV68)感染或者用CpG A刺激小鼠胞漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC),檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中I型干擾素(IFNα和IFNβ)、TNFα和KC的濃度,初步了解在DNA病毒感染或TLR9信號(hào)通路中,IRAK2對(duì)干擾素和前炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)功能;然后在CpG A刺激pDC的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(包括早期和晚期)檢測(cè)IFNα和IFNβ的mRNA表達(dá),并制備CpG A刺激pDC的核提取物,

7、western blot檢測(cè) CpG A刺激下 IRF7的核轉(zhuǎn)位,作為激活 I型干擾素表達(dá)的指標(biāo);用western blot檢測(cè)IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化,以觀(guān)察IRAK2在TLR9信號(hào)通路中對(duì)NF-κB和MAP激酶信號(hào)激活的作用;進(jìn)一步在BMMs中,研究IRAK2對(duì)TLR9介導(dǎo)的NF-κB和MAP激酶信號(hào)激活、對(duì)TNFα表達(dá)和分泌的影響,比較野生型和IRAK2缺失BMMs中基因表達(dá)普的差別,以及IRAK2與其他信號(hào)分子之

8、間的相互作用,探討IRAK2對(duì)TLR9介導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　IRAK2基因缺失小鼠在腹腔注射20mg/ml的LPS后7天仍有80％以上存活,而相應(yīng)的野生型小鼠則不到20%存活,顯示IRAK2基因缺失小鼠對(duì)LPS誘導(dǎo)的膿膿毒性休克耐受,且IRAK2基因缺失小鼠血清中的前炎癥細(xì)胞因子IL1β、IL6、TNFα的濃度比野生型小鼠低;BMMs在LPS和R848刺激下,IRAK2缺失的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(I

9、L6、TNFα)和趨化因子(KC,即 CXCL1)比野生型細(xì)胞明顯減少;BMMs在LPS誘導(dǎo)1.5h后,野生型和IRAK2缺失細(xì)胞表達(dá)的mRNA水平接近,但在放線(xiàn)菌素D處理阻斷基因轉(zhuǎn)錄后,IL6和KC的mRNA在IRAK2缺失的BMMs中降解的速度比野生型細(xì)胞快;在翻譯水平上,在IRAK2缺失的BMMs中檢測(cè)到具有翻譯活性的mRNA所占總 mRNA的百分比低于野生型細(xì)胞,同時(shí),在IRAK2缺失的BMMs中,有翻譯活性mRNA跟無(wú)翻譯活性

10、mRNA的比率亦低于野生型細(xì)胞;LPS誘導(dǎo)的MKK3/6、MnK1和eIF4E的磷酸化及TTP的修飾與穩(wěn)定性在IRAK2缺失的BMMs亦下調(diào),這可能是導(dǎo)致mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性下降,從而導(dǎo)致前炎癥因子的產(chǎn)生減少的原因。體外激酶試驗(yàn)顯示IRAK2具有激酶活性,并且依賴(lài)LPS的刺激而增強(qiáng);用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)將外源IRAK2導(dǎo)入IRAK2基因缺失BMMs后,細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)TLR配體刺激產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子的功能,但表達(dá)IRAK2-WT比表達(dá)IR

11、AK2-KD的BMMs產(chǎn)生的IL6、KC和TNFα多;在mRNA穩(wěn)定性和翻譯水平上,表達(dá)IRAK2-KD的BMMs比表達(dá)IRAK2-WT的BMMs均有明顯的降低。
　　MHV68感染IRAK2缺失pDCs比野生型細(xì)胞產(chǎn)生更多干擾素,且TLR9介導(dǎo)IRF7的核轉(zhuǎn)位和干擾素產(chǎn)生及IκBα、P38、ERK和JNK的磷酸化也在IRAK2缺失的pDCs增加,但前炎癥細(xì)胞因子TNFα和KC在IRAK2缺失的pDCs的分泌比野生型細(xì)胞少;基因表

12、達(dá)譜分析顯示:在TLR9的配體CpG B誘導(dǎo)2h后,IRAK2缺失的巨噬細(xì)胞和野生型細(xì)胞相比,大部分基因表達(dá)增高,而TLR7的配體R848誘導(dǎo)的基因表達(dá)在IRAK2缺失的巨噬細(xì)胞中則減少;定量PCR的結(jié)果顯示:雖然IRAK2缺失的巨噬細(xì)胞在CpG刺激的早期(0.5、1和2h)KC和TNFα的mRNA表達(dá)比野生型細(xì)胞多,但在后期(4h)卻由于降解更快而比野生型細(xì)胞少,所以IRAK2缺失的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNFα、KC和IL6比野生型巨噬細(xì)胞

13、少;此外,野生型BMMs表達(dá)TNFα的百分率比IRAK2缺失的細(xì)胞高,但分泌的TNFα卻比IRAK2缺失的細(xì)胞少;BMMs在R848刺激下,IRAK2與MyD88和TRAF6均發(fā)生相互作用,但在CpG B作用下,IRAK2與TRAF6只有極微弱的結(jié)合,而與MyD88則沒(méi)有相互作用,且沒(méi)有觀(guān)察到IRAK2自身的修飾。
　　結(jié)論:
　　IRAK2缺失導(dǎo)致TLR4、TLR7和TLR9介導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生減少;IRAK2及其蛋白