草魚(yú)白細(xì)胞介素1β的克隆及其在腸道炎癥中的功能鑒定.pdf

1、目的：
　　白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是一種促炎細(xì)胞因子，主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)，在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。草魚(yú)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，但其易遭受多種病原菌和病毒的危害，病原生物通常通過(guò)腸道進(jìn)入草魚(yú)體內(nèi)，使其發(fā)生炎癥乃至死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失。本研究旨在通過(guò)克隆草魚(yú)IL-1β基因，分析其基因結(jié)構(gòu)，明確其在草魚(yú)生理及病理?xiàng)l件下的各組織的表達(dá)水平，揭示

2、該基因在腸道炎癥發(fā)生過(guò)程中的可能作用。
　　方法：
　　運(yùn)用RACE技術(shù)從草魚(yú)中克隆IL-1β全長(zhǎng)cDNA，通過(guò)pET32a(+)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IL-1β融合蛋白，并經(jīng)鎳柱純化獲得具有生物活性的蛋白。運(yùn)用qPCR技術(shù)分別檢測(cè)：（
　　1）健康草魚(yú)各組織的IL-1β轉(zhuǎn)錄水平；
　?。?）用細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）腹腔注射草魚(yú)后4 h，12 h，24 h和48 h時(shí)各組織中IL-1β相對(duì)表達(dá)量。
　?。?）肛灌不

3、同劑量重組IL-1β活性蛋白后炎癥發(fā)生過(guò)程中腸道組織內(nèi)的IL-1β、IL-1R2和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)水平。以割膠純化的草魚(yú)IL-1β重組蛋白為免疫原，制備草魚(yú)IL-1β多克隆抗體，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)抗體的效價(jià)、Western blot驗(yàn)證其特異性。采用肛灌嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)草魚(yú)產(chǎn)生腸道炎癥，誘導(dǎo)12 h后肛灌20 ng/尾的草魚(yú)IL-1β多克隆抗體（rgcIL-1βpAb），用qPCR檢測(cè)腸組織中IL-1β、IL-1R2和TNF-α基

4、因在腸炎發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)變化。采用免疫組化技術(shù)觀察多抗處理3 d后草魚(yú)腸道內(nèi)天然IL-1β蛋白分泌特征。
　　結(jié)果：
　　草魚(yú)IL-1cDNA全長(zhǎng)為1260 bp，包含一個(gè)813 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼長(zhǎng)度為270個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)的分子量為30.1 kDa，氨基酸序列具有IL-1家族特征性序列，但缺乏哺乳動(dòng)物中保守的典型IL-1?轉(zhuǎn)換酶裂解位點(diǎn)。草魚(yú)IL-1基因組DNA長(zhǎng)2863 bp，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。系統(tǒng)

5、進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，草魚(yú)和其他鯉科魚(yú)類(lèi)的IL-1歸為單獨(dú)的一支。健康草魚(yú)肌肉、肝臟、腸道、皮膚、鰭、心臟、腦、體腎、頭腎、鰓和脾臟等11種組織中均有IL-1?表達(dá)，脾臟、鰓、頭腎和體腎中其轉(zhuǎn)錄水平相較其他組織高，經(jīng)LPS刺激魚(yú)體后，IL-1β轉(zhuǎn)錄水平在肌肉、肝臟、腸道、皮膚、體腎、頭腎和鰓中顯著上調(diào)；其中，肌肉、皮膚、鰭和脾臟四種組織的IL-1β表達(dá)在12 h時(shí)上調(diào)至最高后隨即下降，而另外6種組織在24 h時(shí)上調(diào)至最高，隨后下降。不同濃

6、度的草魚(yú)IL-1β活性重組蛋白灌腸后，IL-1βmRNA水平顯著上調(diào)，在刺激24 h時(shí)達(dá)到最高，且5μg/尾魚(yú)劑量表達(dá)量最高，72 h時(shí)則下降；相應(yīng)的，受體基因IL-1R2及下游基因TNF-αmRNA的表達(dá)也上調(diào)，其變化趨勢(shì)與IL-1β基本一致。瓊脂雙擴(kuò)散顯示，所獲多抗的效價(jià)為1:32；Western blot結(jié)果顯示，所制備的多克隆抗體可特異性識(shí)別草魚(yú)IL-1β蛋白。用嗜水氣單胞菌肛灌誘導(dǎo)的草魚(yú)腸道炎癥12 h后肛灌草魚(yú)IL-1β多克