利用rna干擾誘導(dǎo)ace基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究

1、山西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文利用RNA干擾誘導(dǎo)ACE基因沉默治療自發(fā)性高血壓大鼠的研究姓名：何軍華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：心血管內(nèi)科指導(dǎo)教師：肖傳實(shí)20070528lIJ西醫(yī)科丈學(xué)博士學(xué)位論文因，故轉(zhuǎn)染后48小時(shí)可在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，尋求轉(zhuǎn)染效率較高且細(xì)胞毒性較低的pACEshRNA與METAFECTENE的最佳配比。3質(zhì)粒pACEshRNA抑制大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE表達(dá)的研究：用pACE

2、shRNA與METAFECTENE的最佳配比復(fù)合物轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h收集細(xì)胞，用RTPCR及Westernblot法檢測(cè)ACEmRNA及相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)。大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞分為四組：①空白對(duì)照組(細(xì)胞內(nèi)不加任何干擾因素)；②質(zhì)粒對(duì)照組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒)；③pACEshRNAI組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pACE。shRNAl)；④pACEshRNA2組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染pACEshRNA2)。4構(gòu)建靶向抑制大鼠

3、ACE基因的shRNA重組腺病毒載體：利用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，自先期構(gòu)建的pACEshRNA真核表達(dá)載體中酶切出ACEshRNA片段，克隆入穿梭質(zhì)粒pDC316中，然后將穿梭質(zhì)粒pDC316EGFPACEshRNAU6和腺病毒骨架質(zhì)粒paHGIox_E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成重組的腺病毒載體Ad5EGFPACEshRNA并擴(kuò)增、純化、鑒定。5腺病毒介導(dǎo)的ACEshRNA對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的治療作用：自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)

4、分為三組：①空白對(duì)照組(尾靜脈注射生理鹽水)；②病毒對(duì)照組(尾靜脈注射對(duì)照腺病毒Ad5一EGFP)；③治療組(尾靜脈注射Ad5EGFPACEshRNA)；同時(shí)設(shè)正常血壓對(duì)照組(尾靜脈注射生理鹽水)。以上各組大鼠均注射兩次，注射時(shí)間均為實(shí)驗(yàn)的第1天和第16天。實(shí)驗(yàn)期間做以下檢測(cè)：①注射前后檢測(cè)血壓、心率的變化。②首次注射后第3天，取治療組大鼠心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織，做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腺病毒載體吸收情況。③首次注射后第3天，心臟體

5、外采血用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中ACE的含量，并且用RTPCR及Westernblot法檢測(cè)心肌、主動(dòng)脈、腎臟組織中ACEmRNA及相應(yīng)功能蛋白的差異表達(dá)。④實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取各組大鼠心肌，做光鏡及電鏡切片，并檢測(cè)大鼠全心／體重、左心室／體重，及心肌羥脯氨酸、膠原蛋白的含量，以觀察心肌重構(gòu)的變化。同時(shí)采血檢測(cè)肝腎功能。結(jié)果1經(jīng)DNA測(cè)序和酶切鑒定，證明我們構(gòu)建的靶向抑制大鼠ACE基因的shRNA真核表達(dá)載體一重組質(zhì)粒pACEshRNA

6、l與pACEshRNA2無(wú)基因突變，符合實(shí)驗(yàn)要求。2①植塊培養(yǎng)3天左右倒置相差顯微鏡觀察即可發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊周圍移出，大約10天左右細(xì)胞開始融合成片，呈“鋪路石樣”。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞和原代形態(tài)相似，生長(zhǎng)較快，4～5天可以融合成單層，大概傳3～4代左右時(shí)，細(xì)胞開始變性變形、脫落，不再繼續(xù)生長(zhǎng)。用免疫熒光法鑒定可見(jiàn)胞漿內(nèi)有大量綠色熒光表達(dá)。②根據(jù)轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞生存率測(cè)定結(jié)果，篩選出質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的最佳配比為pACEshRNA10