甲醛通過激活NOS抑制內(nèi)源性H2S生成而損傷PC12細(xì)胞.pdf

1、背景與目的：
　　甲醛(formaldehyde, FA)是化學(xué)結(jié)構(gòu)最簡單的醛類分子，可通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成，引起氧化應(yīng)激而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。內(nèi)源性硫化氫(Hydrogen sulfide, H2S)作為第三種氣體信號分子，是機(jī)體內(nèi)重要的神經(jīng)保護(hù)因子和抗氧化劑。因此，我們推測甲醛通過抑制H2S生成而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
　　同時，有文獻(xiàn)證實(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過量一氧化氮(N

2、itric oxide, NO)可抑制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)硫化氫(H2S)合酶胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-bata-synthase, CBS)的活性。因此，我們推測甲醛可促進(jìn)NO過度生成而抑制硫化氫的生成，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性。
　　為此，本課題將以甲醛損傷PC12細(xì)胞為甲醛神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型，探討甲醛是否通過促進(jìn)NO過度生成而抑制H2S的生成，進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性。
　　方法：
　　以甲醛損傷

3、PC12細(xì)胞為甲醛神經(jīng)毒性細(xì)胞模型，采用trypan blue dye exclusion、MTT、Cell Counting Kit-8檢測PC12細(xì)胞的活力；Hoechst33258染色和PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；DCFH-DA染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS累積情況；亞甲基藍(lán)顯色法檢測PC12細(xì)胞上清液中 H2S的含量和PC12細(xì)胞CBS的活性；Western Blot檢測PC12細(xì)胞CBS蛋白的表達(dá)；利用RNA干擾技術(shù)沉默PC12細(xì)

4、胞CBS的表達(dá)；一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)NOS活性；NO試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中NO的水平。
　　結(jié)果：
　　1.甲醛對PC12細(xì)胞的活力和內(nèi)源性H2S生成的抑制作用甲醛(60、120、240μmol/L)處理PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞活力和細(xì)胞培養(yǎng)基中H2S含量呈濃度依賴性地減少，甲醛(120μmol/L和240μmol/L,24h)可降低細(xì)胞H2S生成酶CBS的表

5、達(dá)及其活性，提示甲醛的神經(jīng)毒性可能與其抑制CBS表達(dá)和活性、降低H2S生成有關(guān)。
　　2.抑制內(nèi)源性H2S的生成加劇甲醛對PC12細(xì)胞的毒性作用利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，將CBS-siRNA轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞后，CBS的表達(dá)顯著降低，H2S的產(chǎn)生明顯減少。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CBS-siRNA與甲醛(120μmol/L)共處理24h后，可加重甲醛對PC12細(xì)胞活力的抑制作用、加劇甲醛對PC12細(xì)胞凋亡和ROS累積的誘導(dǎo)作用，表明抑

6、制H2S生成可加重甲醛的神經(jīng)毒性。
　　3.甲醛通過促進(jìn)NO生成而抑制PC12細(xì)胞內(nèi)H2S的生成甲醛(120、240μmol/L)處理 PC12細(xì)胞24h后，細(xì)胞NOS的活性明顯增強(qiáng)，同時細(xì)胞上清液中NO含量明顯增加。提前30min給予160μmol/L的非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)可顯著抑制甲醛對PC12細(xì)胞NOS的激活作用、減輕甲醛對NO生成的促進(jìn)作用、降低甲醛對P

7、C12細(xì)胞CBS表達(dá)和活性以及H2S生成的抑制作用，表明甲醛可通過過度激活 NOS、促進(jìn) NO大量生成而抑制 H2S的生成。
　　4.抑制NO的生成可拮抗甲醛的神經(jīng)毒性提前30min給予160μmol/L的ADMA可顯著減輕甲醛(120μmol/L,24h)對PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，抑制甲醛(120μmol/L,24h)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，降低甲醛(120μmol/L,24h)對PC12細(xì)胞ROS的積累作用，表明抑制NO的生