鈣敏感受體通過胱硫醚-γ-裂解酶調(diào)控內(nèi)源性H2S抑制巨噬細胞泡沫化的機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)為大動脈及中動脈的血管內(nèi)壁出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，形成分散的或成片的粥樣斑塊，造成動脈管腔狹窄，隨后斑塊破裂出血，可以在狹窄的動脈內(nèi)形成血栓，導(dǎo)致缺血性腦卒中、心肌梗死的發(fā)生。引起AS的原因很復(fù)雜，除高血壓外，脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥反應(yīng)以及自身免疫也是重要因素。所以，預(yù)防AS的發(fā)生并防止其發(fā)展，對防治心腦血管疾病有重要意義。
　　硫化氫(H2S)是新發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性氣體信號分子。內(nèi)源性

2、H2S是機體多種細胞內(nèi)半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和半胱氨酸轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生的。其中CSE能大量地表達于血管平滑肌細胞(VSMC-s)、動脈內(nèi)皮細胞(ECs)和單核源性巨噬細胞并產(chǎn)生H2S，是心血管系統(tǒng)H2S的主要來源，而CSE催化產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S不但在擴張血管、促進凋亡和抑制增殖等方面起作用，還在AS的形成過程中起到重要作用。
　　鈣敏感受體(CaR)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中C家族的成

3、員。已有研究報道CaR在巨噬細胞中不僅存在表達，而且能夠通過G蛋白-PLC-IP3通路引起細胞內(nèi)Ca2+含量的增加，細胞內(nèi)Ca2+含量的增加又可以通過Ca2+/CaM通路增強鈣調(diào)蛋白(CaM)的活性，從而抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化。還有研究報道高表達的CaM可以通過提高CSE的活性，促進H2S的生成來抑制泡沫細胞的形成。但CaR是否能夠通過促進巨噬細胞內(nèi)CSE的表達和H2S的分泌來抑制泡沫細胞的形成尚不得而知。 PI3K/Akt信號通

4、路是維持細胞生存、增殖最重要的信號傳導(dǎo)通路之一，可以直接影響AS的發(fā)生發(fā)展。研究證實CaR可以通過影響PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)來抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化，但CaR調(diào)控PI3-K/AKT信號通路傳導(dǎo)的具體機制尚不清楚。因此，本文以巨噬細胞作為研究對象，利用ox-LDL誘導(dǎo)泡沫細胞形成，探討高表達的CaR是否能夠通過增強CSE的表達及促進H2S的分泌來抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉(zhuǎn)化，同時研究CaR調(diào)控CSE的表達是否與CaM有關(guān)。<

5、br>　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　細胞株
　　THP-1人單核巨噬細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，該細胞株屬人類單核細胞系。
　　二、主要研究方法
　　1、細胞培養(yǎng)及建立泡沫細胞模型
　　2、敏感硫電極法檢測巨噬細胞中H2S含量的變化。
　　3、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)測定巨噬細胞內(nèi)游離鈣的變化。
　　4、HPLC測定細胞內(nèi)膽固醇含量及油

6、紅O染色檢測陽性細胞的相對含量。
　　5、ELISA法檢測細胞因子IL-10、MIF和TNF-a的分泌情況。
　　6、RT-PCR、Q-PCR法檢測各組細胞中CaR和CSE的表達。
　　7、Western blot法檢測各組細胞中CaR、CSE、PI3K、p-AKT、CD36和AC-AT-1的表達。
　　8、統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，所得結(jié)果用均數(shù)±SD表示，采用ANOVA分析。P

7、＜0.05認(rèn)為有顯著性差異并在統(tǒng)計學(xué)上有意義。
　　結(jié)果：
　　1、敏感硫電極法檢測H2S的相對含量結(jié)果顯示:與空白對照組比較，CaR激動劑GdCl3(10ug/ml)組和NaHS(70ug/ml)組作用泡沫細24、48和72h后，H2S的相對含量明顯增加（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過48h以后這種促進H2S分泌的作用不再明顯增強;而CaR抑制劑NPS2390(50ug/ml)組作用泡沫細胞24、48和72h后，細胞H2S

8、的相對含量明顯降低（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過48h以后這種抑制H2S分泌的作用不再明顯增強。與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48后H2S的相對含量明顯增加（P＜0.05）;而GdCl3+CSEsiRNA組和CSEsiRNA組H2S的相對含量明顯降低（P＜0.05）。
　　2、油紅O染色檢測和HPLC檢測結(jié)果顯示:與空白對照組比較，GdCl3和NaHS組作用泡沫細胞24、48和72h后，巨噬細胞泡沫化程度均明顯降低（

9、P＜0.05），但當(dāng)其作用超過48h以后這種抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化的作用不再明顯增強;而NPS2390組作用泡沫細胞24、48和72h后，巨噬細胞泡沫化程度明顯增加（P＜0.05），但當(dāng)其作用超過48h以后這種促進巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化的作用不再明顯增強。
　　3、ELISA法檢測作用24、48和72h后的各組細胞上清中IL-10、TNF-a和MIF的分泌情況:結(jié)果顯示，與空白對照組比較，GdCl3和NaHS組細胞上清中TNF

10、-a和MIF含量均明顯降低，而IL-10的含量明顯增多(P＜0.05);NPS2390組細胞培養(yǎng)的上清中TNF-a和MIF的含量均明顯增加，而IL-10的含量明顯降低（P＜0.05）。
　　4、RT-PCR、Q-PCR、Western blot法檢測CaR和CSE的表達情況:結(jié)果顯示，與空白對照組比較，GdCl3組CaR和CSE的表達均明顯增加，而CD36和A-CAT-1的表達被明顯抑制(P＜0.05);NPS2390組CaR和C

11、SE的表達均明顯被抑制，而CD36和ACAT-1的表達被明顯增強（P＜0.05）;NaHS組CaR和CSE的表達無明顯變化，而CD36和ACAT-1的表達被明顯抑制（P＜0.05）。
　　5、RT-PCR、Q-PCR和Western blot檢測CSE、PI3K和p-AKT的表達情況:結(jié)果顯示，與空白對照組比較，GdCl3組明顯增強CSE的表達，而PI3K和p-AKT的表達被明顯抑制;CaM抑制劑(U73122)組和GdCl3+C

12、aM抑制劑(U73122)組PI3K和p-AKT的表達被明顯增強，而CSE的表達被明顯降低(P＜0.05)。
　　6、LSCM檢測作用48h后的各組細胞Ca2+熒光強度變化，結(jié)果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組、U73122組和GdCl3+U73122組細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+熒光強度均明顯增加（P＜0.05）。
　　7、敏感硫電極法檢測H2S的相對含量結(jié)果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48后H2S的相對含量明

13、顯增加（P＜0.05）;而U73122組和GdCl3+U73122組H2S的相對含量明顯降低（P＜0.05）。
　　8、油紅O染色檢測和HPLC檢測結(jié)果顯示:與空白對照組比較，GdCl3組作用泡沫細胞48h后，巨噬細胞泡沫化程度明顯降低（P＜0.05），而U73122組和GdCl3+U73122組巨噬細胞泡沫化程度均明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、證實CaR可以增強CSE的表達，促進內(nèi)源性H2S的分泌，