miR--125b和miR--221在J亞群禽白血病病毒感染過程中作用機制研究.pdf

1、J亞群禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由J亞群禽白血病病毒(subgroup J Avian Leukosis virus，ALV-J)感染引發(fā)的髓細(xì)胞瘤及多發(fā)性器官腫瘤的傳染病。ALV-J誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生不僅因為來自病毒基因的整合、也受到宿主自身的調(diào)控。microRNAs(miRNAs)是一個22nt左右的非編碼RNA分子，其通過種子區(qū)與靶基因3'-UTR的結(jié)合，抑制靶基因的翻譯或降解其mRNA而負(fù)性調(diào)控靶分子。研究證明m

2、iRNAs分子對生命進程的調(diào)控幾乎涉及到生命活動各個方面，在細(xì)胞層面的調(diào)控包括周期、增殖、分化、凋亡等各個細(xì)胞生物學(xué)進程。本實驗室前期研究表明，ALV-J感染的雞腫瘤組織中，gga-miR-221和gga-miR-125b均顯著差異表達(dá)，而它們在人上已經(jīng)作為與腫瘤密切相關(guān)的致瘤因子而被廣泛研究。因此本項目以宿主miR-125b和miR-221分子為研究對象，從分子水平上揭示這兩個microRNAs分子在ALV-J致瘤過程中的可能作用機制

3、。
　　miR-125b分子與細(xì)胞生物進程密切相關(guān)，為了研究其在ALV-J感染致瘤中可能的作用機制，首先通過生物信息學(xué)方法以及熒光素酶報告系統(tǒng)篩選驗證得到miR-125b的4個靶分子為KLF13，PAFAH1B1，PRDM1和Sema4D。然后通過STRING軟件對所得4個靶基因分別進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)KLF13，PAFAH1B1和PRDM1與細(xì)胞活性、細(xì)胞骨架或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等腫瘤生成過程相關(guān)，Sema4D具有促進肌動蛋白細(xì)

4、胞骨架重組，細(xì)胞信號傳導(dǎo)，血管生成等與腫瘤生成密切相關(guān)的作用。進一步對Sema4D分子在ALV-J感染的組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量檢測，發(fā)現(xiàn)ALV-J可以導(dǎo)致Sema4D的上調(diào)表達(dá)。對細(xì)胞凋亡過程中的功能研究發(fā)現(xiàn)Sema4D具有抑制禽多種細(xì)胞凋亡作用。以上表明Sema4D分子可能作為致瘤基因而促進雞體的腫瘤生成。
　　已有報道m(xù)iR-221在腫瘤生成過程中發(fā)揮了重要作用，為了揭示其在ALV-J導(dǎo)致的腫瘤中發(fā)揮的作用，首先通過生物信息學(xué)方法

5、以及熒光素酶報告系統(tǒng)預(yù)測并驗證了miR-221的一個靶分子為CDKN1B。然后構(gòu)建了ALV-J感染的動物模型以及體外DF1細(xì)胞病毒感染模型，通過相對熒光定量方法檢測ALV-J感染組織內(nèi)以及DF1細(xì)胞內(nèi)CDKN1B表達(dá)量與ALV-J感染的關(guān)系。結(jié)果表明ALV-J的感染在體內(nèi)體外均下調(diào)CDKN1B表達(dá)。進一步對miR-221及其靶基因CDKN1B功能研究發(fā)現(xiàn)ALV-J，miR-221和CDKN1B-siRNA-846具有促進DF1細(xì)胞增殖活

6、性及G1/S周期轉(zhuǎn)化的作用。而miR-221抑制物和CDKN1B過表達(dá)具有與之相反的作用。ALV-J感染細(xì)胞的miR-221敲低實驗和CDKN1B過表達(dá)實驗表明miR-221抑制物和CDKN1B具有抑制ALV-J對細(xì)胞增殖和周期促進的作用。以上均表明ALV-J在促進腫瘤生成過程中通過miR-221抑制CDKN1B的作用而促進腫瘤相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)進程。最后對細(xì)胞周期通路分析發(fā)現(xiàn)ALV-J對細(xì)胞周期和增殖活性的促進作用實質(zhì)上是miR-221通

7、過抑制CDKN1B而釋放了CDKN1B-CDK2/CDK6通路中CDK2和CDK6的表達(dá)而發(fā)揮的促進細(xì)胞周期作用。
　　本研究鑒定了miR-125b的4個與腫瘤生成相關(guān)的靶分子，其中Sema4D具有抑制禽多種細(xì)胞凋亡的功能，是一個潛在的致瘤基因，鑒定了miR-221的1個靶分子CDKN1B，以及在雞體內(nèi)ALV-J通過miR-221-CDKN1B-CDK2/CDK6通路促進細(xì)胞過度增殖的新的致瘤通路。本研究為ALV-J致病性的研究提