成骨細(xì)胞礦化過程中microRNA表達(dá)譜分析及miR-93的功能研究.pdf

1、第一部分小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中microRNA表達(dá)譜的分析
　　 目的:
　　 誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞礦化，研究小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中microRNA表達(dá)譜的變化。
　　 方法:
　　 體外手術(shù)分離培養(yǎng)新生小鼠顱骨原代成骨細(xì)胞，使用β-甘油磷酸(β-glycerophosphate，β-GP)和抗壞血酸(ascorbic acid)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞礦化，茜素紅(Alizarin Red S)染色實(shí)驗(yàn)觀察成骨細(xì)胞的礦

2、化情況。建立了誘導(dǎo)小鼠原代顱骨成骨細(xì)胞礦化的細(xì)胞模型。應(yīng)用miRNA微陣列技術(shù)，分析小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中miRNA表達(dá)譜的變化。通過qRT-PCR方法驗(yàn)證表達(dá)明顯變化的miRNA在小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中的表達(dá)情況。選取表達(dá)顯著降低的miR-93作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　 結(jié)果:
　　 (1)采用體外手術(shù)分離法成功從小鼠顱骨分離出原代成骨細(xì)胞。
　　 (2)β-GP和抗壞血酸誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)至7天后，可見茜

3、素紅染色陽性的礦化結(jié)節(jié)形成。
　　 (3)用miRNA microarray芯片檢測(cè)小鼠成骨細(xì)胞礦化化過程中miRNA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA中表達(dá)明顯上調(diào)的有3個(gè)，分別是:mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210;表達(dá)明顯下調(diào)的有6個(gè)，分別是:mmu-miR-93，mmu-miR-103，mmu-miR-92b，mmu-miR-674，mmu-miR-351，mmu-miR-24。以m

4、mu-miR-93表達(dá)下調(diào)最為明顯。
　　 (4)對(duì)差異表達(dá)最明顯的miRNA進(jìn)一步行實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)定量PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，表明miRNA芯片結(jié)果是可靠的。
　　 結(jié)論:
　　 建立了誘導(dǎo)小鼠原代顱骨成骨細(xì)胞礦化的細(xì)胞模型。應(yīng)用microRNA芯片發(fā)現(xiàn)小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中，mmu-miR-98，mmu-miR-130a，mmu-miR-210表達(dá)明顯上調(diào)，而mmu-miR-93，mmu-m

5、iR-103, mmu-miR-92b, mmu-miR-674, mmu-miR-351, mmu-miR-24表達(dá)明顯下調(diào)。以mmu-miR-93表達(dá)下調(diào)最為顯著。
　　 第二部分miR-93對(duì)成骨細(xì)胞礦化的功能研究
　　 目的:
　　 研究miR-93在小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中的作用。
　　 方法:
　　 用β-GP和抗壞血酸誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞礦化，Northern印跡雜交檢測(cè)miR-93在此過

6、程中的表達(dá)模式。根據(jù)miR-93前體序列設(shè)計(jì)引物，用PAJ-U6-CMV-eGFP vector合成miR-93慢病毒穩(wěn)定表達(dá)載體pre-miR-93。將pre-miR-93轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞，構(gòu)建pre-miR-93過表達(dá)細(xì)胞模型，加入β-GP和抗壞血酸誘導(dǎo)分化，Northern雜交檢測(cè)miR-93表達(dá)變化，茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞礦化水平。
　　 結(jié)果:
　　 (1)抗壞血酸和β-GP誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞礦化過程中，隨著誘導(dǎo)

7、時(shí)間延長，miR-93表達(dá)逐漸降低。
　　 (2)用PAJ-U6-CMV-eGFP vector成功構(gòu)建miR-93慢病毒穩(wěn)定表達(dá)載體pre-miR-93，能在細(xì)胞中高表達(dá)miR-93。
　　 (3) miR-93過表達(dá)能抑制成骨細(xì)胞礦化形成，降低礦化結(jié)節(jié)茜素紅定量。
　　 結(jié)論:
　　 構(gòu)建了miR-93表達(dá)載體，過表達(dá)miR-93可以抑制小鼠成骨細(xì)胞礦化。
　　 第三部分miR-93調(diào)控成骨細(xì)

8、胞礦化的機(jī)制研究
　　 目的:
　　 預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-93與其作用的靶基因間的相互作用，闡明miR-93/Sp7調(diào)控環(huán)路在小鼠成骨細(xì)胞礦化的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 用TargetScan和rna22等靶基因預(yù)測(cè)軟件分析得到小鼠原miR-93的靶基因。將含有miR-93結(jié)合位點(diǎn)的靶基因Sp7(trans-actingtranscription factor7，Osterix) CDS片段克隆到pG

9、L3載體，構(gòu)建野生型報(bào)告載體WT-pGL3-Sp7-CDS。用QuickChange site-directedmutagenesis試劑盒構(gòu)建了含有突變靶位點(diǎn)的突變型報(bào)告載體MUT-pGL3-Sp7-CDS。將這兩個(gè)載體分別與pre-miR-93或?qū)φ?miR-C)共同轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化以證實(shí)該靶基因是否為miR-93作用的靶基因。小鼠成骨細(xì)胞單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-93，Western印跡雜交和實(shí)時(shí)定量PCR分別

10、檢測(cè)靶基因Sp7蛋白和mRNA水平的變化，明確miR-93對(duì)靶基因Sp7的調(diào)控作用。PCR擴(kuò)增Sp7的CDS區(qū)全長，連接到pAJ慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建野生型Sp7-CDS表達(dá)載體，同時(shí)用QuickChange site-directed mutagenesis試劑盒構(gòu)建了含突變靶點(diǎn)的突變型Sp7-CDS表達(dá)載體。將這兩個(gè)表達(dá)載體分別與pre-miR-93或miR-C共同轉(zhuǎn)染小鼠顱骨成骨細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞礦化小結(jié)的形成，靶

11、基因蛋白表達(dá)用Western印跡雜交檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)Sp7為miR-93在成骨細(xì)胞礦化過程中重要的靶基因。通過公布的小鼠轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)預(yù)測(cè)文庫，根據(jù)第四位賴氨酸三甲基化的H3組蛋白(H3K4me3)在TSS位點(diǎn)周圍的富集與啟動(dòng)子CpG島為主要標(biāo)識(shí)，預(yù)測(cè)miR-93的TSS。運(yùn)用TF-seach轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析miR-93的TSS上游2kb內(nèi)的DNA序列，預(yù)測(cè)miR-93啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。通過凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)

12、(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)，驗(yàn)證Sp7與所預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的相互關(guān)系。采用轉(zhuǎn)錄因子熒光素酶報(bào)告基因活性進(jìn)一步驗(yàn)證Sp7與miR-93的TSS上游2kb內(nèi)的DNA序列的結(jié)合及對(duì)miR-93的轉(zhuǎn)錄抑制作用。通過PCR擴(kuò)增Sp7 cDNA并亞克隆至pAJ載體，構(gòu)建Sp7表達(dá)載體pAJ-Sp7，慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，并構(gòu)建特異性阻斷Sp7蛋白表達(dá)的慢病毒短發(fā)卡RNA(shRNA)-Sp7表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，分別采

13、用Northern blot和qRT-PCR檢測(cè)miR-93的表達(dá)，研究Sp7對(duì)miR-93表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:
　　 (1) TargetScan和rna22等靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)Sp7為miR-93作用的靶基因。
　　 (2)與轉(zhuǎn)染miR-C對(duì)照組相比，pre-miR-93和WT-pGL3-Sp7-CDS共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到明顯的抑制，而pre-miR-93和MUT-pGL3-Sp7-CDS共轉(zhuǎn)

14、染組的熒光素酶活性則無明顯變化。
　　 (3)單獨(dú)轉(zhuǎn)染pre-miR-93可以降低Sp7蛋白水平，而對(duì)Sp7mRNA水平無影響。
　　 (4) pre-miR-93與WT-pAJ-Sp7共同轉(zhuǎn)染能減少成骨細(xì)胞礦化，降低Sp7蛋白表達(dá)水平;而pre-miR-93與MUT-pAJ-Sp7共同轉(zhuǎn)染不能降低成骨細(xì)胞礦化水平，對(duì)Sp7蛋白水平?jīng)]有影響，突變型Sp7 CDS全長可以消除miR-93所致的對(duì)成骨細(xì)胞礦化的抑制作用及其對(duì)

15、Sp7蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　 (5) TF search轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)Sp7在miR-93的TSS上游2kb內(nèi)的DNA序列的結(jié)合。
　　 (6)凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)(EMSA)示Sp7蛋白與靶結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，特異性Sp7抗體驗(yàn)證了Sp7的存在，靶結(jié)合位點(diǎn)的突變則無蛋白質(zhì)與結(jié)合結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。
　　 (7) ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sp7結(jié)合于所預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 (8)與轉(zhuǎn)染control對(duì)照組

16、相比，Sp7和WT-pGL3-promoter共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性受到明顯的抑制，而Sp7和MUT-pGL3-miR-93-promoter共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性則無明顯變化。因此，我們認(rèn)為miR-93主要通過抑制Sp7蛋白表達(dá)來抑制成骨細(xì)胞礦化，而Sp7可以通過抑制miR-93的轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化。
　　 (9)單獨(dú)轉(zhuǎn)染Sp7可以降低miR-93的表達(dá)水平，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染sh-Sp7可以提高miR-93的表達(dá)水平。

17、　　 結(jié)論:
　　 (1)構(gòu)建了野生型和突變型Sp7 CDS熒光素酶報(bào)告基因載體、miR-93表達(dá)載體、野生型和突變型miR-93啟動(dòng)子區(qū)靶結(jié)合序列熒光素酶報(bào)告基因載體以及野生型和突變型Sp7 CDS全長慢病毒表達(dá)載體。
　　 (2)通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)Sp7為miR-93作用的靶基因，且通過靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)并經(jīng)凝膠遷移滯后實(shí)驗(yàn)、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)Sp7為