機(jī)械性牽張力在破骨細(xì)胞形成過程中作用的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、體外破骨細(xì)胞的形成及功能變化受牽張應(yīng)力的影響，且不同的施力大小及不同的作用時(shí)間對破骨細(xì)胞的形成及功能的影響是不同的。但到目前為止，有關(guān)牽張應(yīng)力導(dǎo)致破骨細(xì)胞生物學(xué)行為變化的分子機(jī)制尚不清楚。通過差異蛋白質(zhì)組研究可以識別參與細(xì)胞生命活動過程中的重要蛋白質(zhì)，為深入探索其機(jī)制提供信息。因此，本課題應(yīng)用細(xì)胞牽張應(yīng)力培養(yǎng)模型，以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為平臺，通過蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳、蛋白質(zhì)染色、肽質(zhì)量指紋圖譜分析，結(jié)合現(xiàn)代計(jì)算機(jī)信息學(xué)和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)通訊技術(shù)，首

2、次觀察牽張應(yīng)力在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)形成第5d 及第9d的蛋白質(zhì)組變化情況，定量、定性分析其蛋白差異，進(jìn)一步明確牽張應(yīng)力在不同階段通過那些關(guān)鍵蛋白質(zhì)調(diào)控破骨細(xì)胞的形成及功能，尋找和發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵因子，探討牽張應(yīng)力對破骨細(xì)胞形成及功能影響的分子機(jī)制，為牽張應(yīng)力狀態(tài)下的骨改建機(jī)理的更深入研究提供依據(jù)。 研究目標(biāo)：1.探索適合蛋白組學(xué)研究的骨髓破骨細(xì)胞培養(yǎng)方法；2.建立骨髓破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化早期、末期階段的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜；3. 識別機(jī)械

3、性牽張力作用下與骨髓破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化相關(guān)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)；4.鑒定牽張應(yīng)力在不同階段通過那些關(guān)鍵蛋白質(zhì)調(diào)控破骨細(xì)胞的形成。為牽張應(yīng)力狀態(tài)下骨改建機(jī)理的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容：1. 人骨髓破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定。2. 體外牽張應(yīng)力加載細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立。3.不同時(shí)段牽張應(yīng)力作用下，人骨髓誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜的建立。4.蛋白斑點(diǎn)的圖像分析。通過對不同時(shí)段人骨髓誘導(dǎo)細(xì)胞以及不同時(shí)段牽張應(yīng)力作用下人骨髓誘導(dǎo)細(xì)胞雙

4、向凝膠蛋白斑點(diǎn)的圖像分析，比較牽張應(yīng)力與非牽張應(yīng)力條件下，不同時(shí)段骨髓誘導(dǎo)細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。5.雙向電泳差異蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋分析。提取在牽張應(yīng)力與非牽張應(yīng)力條件下，不同時(shí)段骨髓誘導(dǎo)細(xì)胞明顯差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽片斷，測定肽質(zhì)量指紋圖譜。6.相關(guān)蛋白斑點(diǎn)的鑒定。通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的表觀分子量進(jìn)行綜合分析，鑒定出與骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)及牽張應(yīng)力相關(guān)的蛋白質(zhì)。7.從鑒定的蛋白質(zhì)的功能信息推導(dǎo)骨髓破骨細(xì)胞誘導(dǎo)及牽張應(yīng)力對骨髓破骨細(xì)

5、胞形成及功能影響的分子機(jī)制。 研究方法：1. 采用GM-CSF 誘導(dǎo)培養(yǎng)方法培養(yǎng)人骨髓破骨細(xì)胞；2. 第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科與醫(yī)學(xué)電子工程系合作研制的多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)用于體外牽張力的加載；3.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及初步結(jié)果，選擇破骨細(xì)胞聚集早期以及細(xì)胞成熟期兩個時(shí)間點(diǎn)，即細(xì)胞培養(yǎng)第5d 及第9d 樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳；4. 使用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laserdeso

6、rption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) 分析肽質(zhì)量指紋圖譜（Peptide mapping fingerprint, PMF）；5. 通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的表觀分子量進(jìn)行綜合分析，鑒定出與骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)及牽張應(yīng)力相關(guān)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果：1.牽張力作用下的人骨髓破骨細(xì)胞培養(yǎng)第5d 細(xì)胞開始大量聚集，第9d形成最為典型的破骨

7、細(xì)胞，但數(shù)量開始減少；2. 骨髓破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化各階段的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)結(jié)果顯示，牽張力作用于破骨細(xì)胞的第5d，有13 個蛋白點(diǎn)的表達(dá)存在明顯差異，其中新增蛋白點(diǎn)1 個,缺失7 個,2 個蛋白點(diǎn)表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào),3 個蛋白點(diǎn)發(fā)生明顯下調(diào)；第9d 顯示有15 個蛋白點(diǎn)的表達(dá)存在明顯差異，其中新增蛋白點(diǎn)5 個,缺失6 個,1 個蛋白點(diǎn)表達(dá)發(fā)生明顯上調(diào),3 個蛋白點(diǎn)發(fā)生明顯下調(diào)；3. 通過對制備好的樣品進(jìn)行MALDI-TOF-M

8、S 分析，得到了其中10 個蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜；4.將得到肽質(zhì)量指紋圖譜的10 個蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析，通過應(yīng)用多個數(shù)據(jù)庫檢索和對比鑒定出4 個蛋白質(zhì)，分別是：Glyceraldehyde-3 -phosphatedehydrogenase 、Actin-cytoplasmic 1 、Alpha-enolase 、Serine/threonine-proteinphosphatase PP1。其余6 個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為未知蛋白。 結(jié)