機械性牽張力在破骨細胞形成過程中作用的差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、體外破骨細胞的形成及功能變化受牽張應(yīng)力的影響，且不同的施力大小及不同的作用時間對破骨細胞的形成及功能的影響是不同的。但到目前為止，有關(guān)牽張應(yīng)力導致破骨細胞生物學行為變化的分子機制尚不清楚。通過差異蛋白質(zhì)組研究可以識別參與細胞生命活動過程中的重要蛋白質(zhì)，為深入探索其機制提供信息。因此，本課題應(yīng)用細胞牽張應(yīng)力培養(yǎng)模型，以蛋白質(zhì)組學技術(shù)為平臺，通過蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳、蛋白質(zhì)染色、肽質(zhì)量指紋圖譜分析，結(jié)合現(xiàn)代計算機信息學和計算機網(wǎng)絡(luò)通訊技術(shù)，首

2、次觀察牽張應(yīng)力在破骨細胞誘導形成第5d 及第9d的蛋白質(zhì)組變化情況，定量、定性分析其蛋白差異，進一步明確牽張應(yīng)力在不同階段通過那些關(guān)鍵蛋白質(zhì)調(diào)控破骨細胞的形成及功能，尋找和發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵因子，探討牽張應(yīng)力對破骨細胞形成及功能影響的分子機制，為牽張應(yīng)力狀態(tài)下的骨改建機理的更深入研究提供依據(jù)。 研究目標：1.探索適合蛋白組學研究的骨髓破骨細胞培養(yǎng)方法；2.建立骨髓破骨細胞誘導分化早期、末期階段的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜；3. 識別機械

3、性牽張力作用下與骨髓破骨細胞誘導分化相關(guān)的差異蛋白質(zhì)點；4.鑒定牽張應(yīng)力在不同階段通過那些關(guān)鍵蛋白質(zhì)調(diào)控破骨細胞的形成。為牽張應(yīng)力狀態(tài)下骨改建機理的進一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容：1. 人骨髓破骨細胞的誘導培養(yǎng)及鑒定。2. 體外牽張應(yīng)力加載細胞培養(yǎng)體系的建立。3.不同時段牽張應(yīng)力作用下，人骨髓誘導細胞蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜的建立。4.蛋白斑點的圖像分析。通過對不同時段人骨髓誘導細胞以及不同時段牽張應(yīng)力作用下人骨髓誘導細胞雙

4、向凝膠蛋白斑點的圖像分析，比較牽張應(yīng)力與非牽張應(yīng)力條件下，不同時段骨髓誘導細胞的差異蛋白質(zhì)點。5.雙向電泳差異蛋白斑點的肽質(zhì)量指紋分析。提取在牽張應(yīng)力與非牽張應(yīng)力條件下，不同時段骨髓誘導細胞明顯差異蛋白質(zhì)點的肽片斷，測定肽質(zhì)量指紋圖譜。6.相關(guān)蛋白斑點的鑒定。通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合差異蛋白質(zhì)點的表觀分子量進行綜合分析，鑒定出與骨髓細胞誘導及牽張應(yīng)力相關(guān)的蛋白質(zhì)。7.從鑒定的蛋白質(zhì)的功能信息推導骨髓破骨細胞誘導及牽張應(yīng)力對骨髓破骨細

5、胞形成及功能影響的分子機制。 研究方法：1. 采用GM-CSF 誘導培養(yǎng)方法培養(yǎng)人骨髓破骨細胞；2. 第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院正畸科與醫(yī)學電子工程系合作研制的多通道細胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)用于體外牽張力的加載；3.根據(jù)預(yù)實驗及初步結(jié)果，選擇破骨細胞聚集早期以及細胞成熟期兩個時間點，即細胞培養(yǎng)第5d 及第9d 樣本進行蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳；4. 使用基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜儀(matrix-assisted laserdeso

6、rption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) 分析肽質(zhì)量指紋圖譜（Peptide mapping fingerprint, PMF）；5. 通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合差異蛋白質(zhì)點的表觀分子量進行綜合分析，鑒定出與骨髓細胞誘導及牽張應(yīng)力相關(guān)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果：1.牽張力作用下的人骨髓破骨細胞培養(yǎng)第5d 細胞開始大量聚集，第9d形成最為典型的破骨

7、細胞，但數(shù)量開始減少；2. 骨髓破骨細胞誘導分化各階段的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳(2-DE)結(jié)果顯示，牽張力作用于破骨細胞的第5d，有13 個蛋白點的表達存在明顯差異，其中新增蛋白點1 個,缺失7 個,2 個蛋白點表達發(fā)生明顯上調(diào),3 個蛋白點發(fā)生明顯下調(diào)；第9d 顯示有15 個蛋白點的表達存在明顯差異，其中新增蛋白點5 個,缺失6 個,1 個蛋白點表達發(fā)生明顯上調(diào),3 個蛋白點發(fā)生明顯下調(diào)；3. 通過對制備好的樣品進行MALDI-TOF-M

8、S 分析，得到了其中10 個蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜；4.將得到肽質(zhì)量指紋圖譜的10 個蛋白點進行分析，通過應(yīng)用多個數(shù)據(jù)庫檢索和對比鑒定出4 個蛋白質(zhì)，分別是：Glyceraldehyde-3 -phosphatedehydrogenase 、Actin-cytoplasmic 1 、Alpha-enolase 、Serine/threonine-proteinphosphatase PP1。其余6 個蛋白質(zhì)斑點為未知蛋白。 結(jié)