MiR-150對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞促深靜脈血栓溶解再通作用的研究.pdf

1、深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis DVT)是常見(jiàn)的外周血管疾病,可導(dǎo)致肢體腫脹、下肢缺血、血栓后綜合癥,甚至致死性肺栓塞的發(fā)生?，F(xiàn)在對(duì)于DVT的治療主要是各種抗凝溶栓藥物的使用,但效果并不令人滿意,同時(shí)抗凝藥物的副作用可導(dǎo)致機(jī)體凝血功能下降、消化道出血、手術(shù)患者切口并發(fā)癥發(fā)生。
　　研究人員發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor c

2、ells BMEPCs)可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,分泌各種促血管生成因子從而促進(jìn)缺血組織的血管新生。研究證實(shí),EPCs可以歸巢到深靜脈血栓中促進(jìn)血栓機(jī)化再通。我們實(shí)驗(yàn)組前期的研究也發(fā)現(xiàn)移植EPCs后可以改善血栓內(nèi)的微環(huán)境,促進(jìn)急性靜脈血栓溶解及慢性血栓再通。但是由于EPCs增殖能力及遷移歸巢能力較弱,EPCs的應(yīng)用受到很大的限制。如何更好的改善 EPCs的功能成為廣大學(xué)者的研究方向。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)小分

3、子非編碼RNAs,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。研究證明MicroRNAs在血管新生過(guò)程中扮演了重要角色。miR-150最初被發(fā)現(xiàn)于免疫相關(guān)細(xì)胞中,控制著淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)分化。研究發(fā)現(xiàn),miR-150可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。單核細(xì)胞分泌的miR-150可以提高人微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及成血管能力。但是,miR-150對(duì)于EPCs的功能影響,特別在深靜脈血栓再通中的作用卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)研究中,我們采用密度梯度離心法分離SD大鼠的

4、骨髓單個(gè)核細(xì)胞(Bone marrow-derived mononuclear cells, BMMNCs),EGM-2MV培養(yǎng)基誘導(dǎo)、培養(yǎng)、擴(kuò)增骨髓源性EPCs并鑒定。體外實(shí)驗(yàn)中,我們將對(duì)照寡核苷酸和miR-150的模擬物或抑制物采用電轉(zhuǎn)的方法,轉(zhuǎn)染EPCs,探討miR-150對(duì)EPCs的功能影響。為了進(jìn)一步研究miR-150對(duì)EPCs在深靜脈血栓機(jī)化再通中的作用,我們構(gòu)建了攜帶miR-150的慢病毒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到大鼠EPCs中,將

5、轉(zhuǎn)染后的EPCs注入到大鼠深靜脈血栓模型中。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)miR-150能夠促進(jìn)大鼠EPCs的遷移成管能力,促進(jìn)EPCs歸巢到靜脈血栓中,加速血栓的機(jī)化再通。我們的研究揭示了miR-150對(duì)EPCs功能的影響,可能為深靜脈血栓治療帶來(lái)新的希望。
　　本實(shí)驗(yàn)研究,將分為4個(gè)部分。主要研究方法及結(jié)果如下。
　　第一部分大鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞(endo

6、thelial progenitor cells, EPCs)。
　　方法:采用密度梯度離心方法分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞,采用內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)劑進(jìn)行誘導(dǎo)分化定向誘導(dǎo)培養(yǎng)14-21天,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)變化,結(jié)合免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記及造血干細(xì)胞表面標(biāo)記,采用Matrigel成管實(shí)驗(yàn)及DiI-ac-LDL攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的功能學(xué)特性。
　　結(jié)果:新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)

7、呈圓形,48 h后部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁,貼壁細(xì)胞呈紡錘型形態(tài),細(xì)胞集落形成,細(xì)胞培養(yǎng)至第10~12天逐漸融合,細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出鵝卵石樣改變。DiI-acLDL攝取結(jié)果顯示,細(xì)胞能夠吸收DiI-ac-LDL。Matrigel成管實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)的細(xì)胞能形成管狀、網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀分析及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞主要表達(dá)內(nèi)皮特異性標(biāo)記物VEGFR、vWF;幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD133。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功地建立了一套大鼠骨髓血管

8、內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法體系。在特定培養(yǎng)體系誘導(dǎo)下,可從大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞,培養(yǎng)到第10-14天的內(nèi)皮祖細(xì)胞呈現(xiàn)late-EPCs表型特征。
　　第二部分 MiR-150對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討miR-150對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、遷移、及成管能力的影響
　　方法:將miR-150模擬物或抑制

9、劑或陰性對(duì)照用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染到EPCs中。采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-150對(duì)EPCs增殖及細(xì)胞周期的影響。采用劃痕實(shí)驗(yàn)、穿膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-150對(duì)EPCs運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響。采用Matrige管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-150對(duì)EPCs成血管能力的影響。為了探查miR-150對(duì)EPCs功能影響的可能靶基因,我們使用在線microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)尋找miR-150調(diào)控EPCs的潛在靶基因。
　　結(jié)果:miR-150對(duì)內(nèi)皮組細(xì)胞的增

10、殖及細(xì)胞周期沒(méi)有影響。劃痕實(shí)驗(yàn)及穿膜實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了miR-150模擬物能夠顯著促進(jìn)EPCs的遷移運(yùn)動(dòng)能力;miR-150抑制劑則能抑制EPCs的遷移運(yùn)動(dòng)能力。過(guò)表達(dá)miR-150能增強(qiáng)EPCs的成管能力。c-Myb的3’UTR區(qū)內(nèi)有miR-150兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)論:miR-150對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期沒(méi)有作用。過(guò)表達(dá)miR-150促進(jìn)大鼠EPCs遷移及運(yùn)動(dòng)及成管能力。c-Myb可能是miR-150的靶基因。
　　第三

11、部分構(gòu)建miR-150慢病毒表達(dá)載體及其在內(nèi)皮祖細(xì)胞有效性表達(dá)
　　目的:構(gòu)建miR-150慢病毒表達(dá)載體,感染大鼠EPCs后檢測(cè)miR-150的表達(dá),為研究體內(nèi)條件下miR-150在EPCs中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到的miR-150前體序列pre-miR-150和慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl經(jīng)酶切后連接產(chǎn)生pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150,經(jīng)酶

12、切及測(cè)序鑒定正確后在HEK293T細(xì)胞中包裝病毒,收集病毒上清后感染EPCs。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)感染后的EPCs中miR-150的表達(dá)。
　　結(jié)果:酶切及測(cè)序結(jié)果示慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150構(gòu)建正確,病毒上清液感染EPCs后能有效提高miR-150的表達(dá)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150慢病毒表達(dá)載體及穩(wěn)定表達(dá)miR-15

13、0的EPCs細(xì)胞系。
　　第四部分 miRNA-150對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞在深靜脈血栓再通中的作用
　　目的:探討miRNA-150對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在血栓機(jī)化再通中的作用。
　　方法:我們通過(guò)結(jié)扎大鼠下腔靜脈構(gòu)建深靜脈血栓模型,將構(gòu)建成功的慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-IRES-ZsGreen1-miR-150轉(zhuǎn)染到EPCs中并

14、移植到血栓模型中。在術(shù)后7天、14天收集標(biāo)本稱(chēng)重。通過(guò)熒光示蹤觀察EPCs歸巢到靜脈血栓的情況。采用HE染色,CD34免疫組化染色觀察轉(zhuǎn)染miR-150后EPCs對(duì)靜脈血栓機(jī)化再通的影響。為了探查miR-150促進(jìn)血栓機(jī)化再通的可能機(jī)制,我們采用免疫組化染色檢測(cè)血栓中MMP-2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:移植的EPCs出現(xiàn)在靜脈血栓中。EPCs/miR-150組中GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較EPCs/vector組明顯增多。EPCs移植后抑制

15、靜脈血栓形成,EPCs/miR-150組中靜脈血栓的重量最低。HE染色和CD34免疫組化染色提示EPCs促進(jìn)血栓的機(jī)化再通。相對(duì)于EPCs/vector組,EPCs/miR-150組中血栓機(jī)化再通最為明顯。不論在術(shù)后7天還是14天,MMP-2在EPCs/miR-150組和EPCs/vecto組的表達(dá)皆高于空白對(duì)照組。其中,EPCs/miR-150組中MMP-2的表達(dá)最為豐富。
　　結(jié)論:移植的EPCs可以歸巢到靜脈血栓中促進(jìn)血栓溶